Para comenzar, retire las tapas superior e inferior de la columna de centrifugación del kit comercial de enriquecimiento de proteínas y guárdelas para usarlas en el futuro. Coloque la columna de centrifugación destapada en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros. Centrifugar la configuración a 1000 G y temperatura ambiente durante 30 a 60 segundos para retirar y desechar la solución de almacenamiento.
Agregue 200 microlitros de tampón de lavado a las perlas de enriquecimiento en la columna de centrifugado y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Después de centrifugar la columna de centrifugación como se demostró anteriormente, deseche el tampón recolectado. Vuelva a colocar la tapa inferior y agregue 200 microlitros de agua a la columna de centrifugado antes de volver a colocar la tapa superior.
Mezcle la suspensión acuosa de perlas preparada pipeteándola hacia arriba y hacia abajo antes de transferir 40 microlitros a la muestra de producto farmacéutico de anticuerpos monoclonales preparada previamente. Incuba el tubo girándolo a temperatura ambiente durante dos horas. A continuación, haz agujeros en una frita de tamaño adecuado con una aguja de calibre 16 e insértala en el extremo de la punta de una punta de 200 microlitros.
Transfiera la muestra con perlas a la punta preparada y colóquela en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros con un orificio en la tapa superior. Centrifuga la punta en el tubo para eliminar la solución. Lave las perlas agregando 200 microlitros de tampón de lavado a la punta.
Retire el tampón de lavado centrifugando la punta en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros. A continuación, lave las perlas de la punta con 200 microlitros de agua y centrifugue como se muestra anteriormente para eliminar el agua. Ahora, agregue 10 microlitros de tampón de elución a la punta y sumerja bien las perlas en él pipeteando la suspensión hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
Transfiera la punta a un nuevo tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros con un orificio en la tapa superior y centrifugue el tubo para recoger la proteína eludida. Agregue 1,5 microlitros de solución de tripsina en el eluyente y déjelo digerir durante la noche a 28 grados. A continuación, añade 1,5 microlitros de 25 miligramos por mililitro de ditiotreitol a la muestra e incuba a 90 grados durante 20 minutos.
A continuación, incubar la muestra con 1,5 microlitros de yodoacetamida 0,25 molar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 minutos. Después de eso, agregue 3,5 microlitros de ácido tricloroacético al 10% o TFA y haga vórtice a la muestra durante dos minutos. Centrifugar la muestra a 14.400 G durante 10 minutos a temperatura ambiente para precipitar SDC y SLS.
Recoja el sobrenadante acidificado para desalinizarlo. Agregue 50 microlitros de tampón B a la punta desalinizadora de GC. A continuación, coloque la punta en un soporte y centrifugérela a 1000 G durante tres minutos a temperatura ambiente.
Agregue 50 microlitros de tampón A a la punta y gírela como se demostró anteriormente. Ahora, agregue la muestra acidificada a la punta. Centrifugar la punta en el soporte a 500 G durante seis minutos a temperatura ambiente.
A continuación, lave la punta añadiéndole 50 microlitros de tampón A y haciéndola girar a 500 g durante tres minutos a temperatura ambiente. Eluir el péptido de la punta desalinizadora de GC añadiendo 50 microlitros de tampón B y centrifugando la punta en un tubo nuevo a 500 G durante tres minutos a temperatura ambiente. Después de eso, seque el eluyente recolectado con un concentrador de vacío.
Vuelva a suspender el eluyente seco en 30 microlitros de solución de ácido fórmico al 0,1%. Mida la absorbancia ultravioleta de las mezclas de péptidos a 214 nanómetros utilizando un espectrofotómetro. Finalmente, transfiera 10 microlitros de la muestra digerida a un vial de muestra de cromatografía líquida y analice un microgramo de la muestra usando nano LC-MS/MS.
Los perfiles de cromatograma iónico total de las proteínas de la célula huésped revelaron que, en comparación con la digestión directa, la mayoría de los principales péptidos de anticuerpos monoclonales se redujeron o eliminaron después del enriquecimiento de proteínas demostrado junto con un protocolo de digestión limitado.
