Prepare una dilución de 12 mililitros de medios de separación al 60% y al 70% en tubos cónicos de 50 mililitros. A continuación, prepare el degradado de abajo hacia arriba añadiendo cuatro mililitros a la vez de la dilución al 60% sobre la dilución al 70% utilizando una pipeta de cinco mililitros. A continuación, coloque con cuidado 12 mililitros de sangre heparinizada sobre el gradiente de densidad y centrifugue a 200 g durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Deseche las capas de plasma y células mononucleares. A continuación, transfiera con cuidado aproximadamente 7,5 mililitros de la capa por encima del gránulo de eritrocitos a dos tubos cónicos de 15 mililitros. Centrifugar los tubos a 300 G durante cinco minutos a 19 grados centígrados.
Proceda a lavar el gránulo celular con la solución salina equilibrada de Hanks o HBSS. A continuación, realice la lisis hipotónica y elimine los glóbulos rojos restantes. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender suavemente los neutrófilos polimorfonucleares en el tampón restante y transfiéralos a un tubo de microcentrífuga helado.
A continuación, transfiera tres alícuotas de un microlitro de la suspensión celular a un portaobjetos de vidrio limpio. Tinción con panóptico rápido para evaluar la morfología y pureza celular. Observe las células bajo un microscopio y cuente 300 células al azar en cada pocillo.
Marque los neutrófilos y otros tipos de células para evaluar la pureza de la separación. A continuación, transfiera un microlitro de la suspensión celular a 49 microlitros de colorante azul de tripano al 0,2 % y cuente las células muertas y viables utilizando una cámara de Neubauer. Ajustar la concentración celular a 6.667 células por microlitro con un 50% de plasma autólogo y un 50% de HBSS suplementado con calcio y magnesio.
A continuación, divida la suspensión celular de manera uniforme entre los tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros correspondientes a las condiciones de prueba, incluido el control negativo. Preparar un sistema de activación para cada condición, asegurando que la concentración celular final se mantenga en 6.600 neutrófilos polimorfonucleares por microlitro. Incubar a 37 grados centígrados sin rotación.
