Comience por tripsinizar las células madre mesenquimales humanas para crear una suspensión celular. A continuación, alícuota la suspensión de la célula en un tubo de 1,5 mililitros para crear 10 construcciones. Después de centrifugar la suspensión a 220 g durante tres minutos, utilice una bomba de vacío para eliminar el sobrenadante.
Ahora, coloque el gránulo de celda sobre hielo. A continuación, lleve el ácido hialurónico modificado con tiol, el reticulante reactivo al tiol, el diacrilato de polietilenglicol y las botellas de agua desgasificada a temperatura ambiente. En condiciones estériles, use una jeringa equipada con aguja para agregar un mililitro de agua desgasificada a la botella que contiene ácido hialurónico.
Agite la solución, calentándola ocasionalmente a 37 grados centígrados hasta que se aclare. Luego, coloque la solución en hielo. En condiciones estériles, agregue 5 mililitros de agua desgasificada a la botella de reticulación.
Disuélvelo invirtiendo repetidamente antes de colocarlo en hielo. Ahora, agregue 120 microlitros de la solución de ácido hialurónico disuelto al gránulo de la célula alícuota y vuelva a suspender el gránulo de la célula pipeteando la solución de un lado a otro. Agregue 30 microlitros de la solución de reticulante disuelta en el tubo con el gránulo de celda resuspendida.
Asegúrese de que la mezcla sea adecuada dando golpecitos en el tubo. Después de mezclar, gire brevemente la solución. Deje caer 15 microlitros de la solución combinada en una placa de 24 pocillos recubierta de parafina.
Deje que se solidifique a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Para la diferenciación in vitro, añadir 0,5 mililitros de medio de diferenciación condrogénico a los hidrogeles asentados en la célula. Después de tres semanas, cambie al medio de diferenciación hipertrófica, agregando 0,5 mililitros por pocillo.
La diferenciación condrogénica dio lugar a glicosaminoglicanos sulfatados en la matriz extracelular positiva de colágeno tipo 2 tanto en las construcciones de ácido hialurónico como de HA y colágeno. Sin embargo, la distribución fue más homogénea en las construcciones de ácido hialurónico. Las construcciones de colágeno demostraron células periféricas con morfología heterogénea.
La redondez promedio de las células en las construcciones de AH fue mayor que en las construcciones de colágeno. Se detectó deposición de calcio en los bordes externos de ambas construcciones a las cinco semanas. En las construcciones in vivo de AH, todos los implantes se unieron entre sí en bolsas subcutáneas y formaron tejido óseo integrado.
El 40% de las construcciones de colágeno in vivo fueron independientes. El tejido osteoide con morfología laminar se formó en las regiones externas de ambas construcciones in vivo a las ocho semanas después de la implantación. También se observó pérdida de cartílago en el constructo AH.
Múltiples construcciones in vivo de AH parecieron formar tejido óseo integrado, como lo indica la conexión con los tejidos óseos y la presencia de tejido fibroso articular. Mientras que el 40% de las construcciones de colágeno estaban unidas, las construcciones restantes existían separadas o solo estaban unidas sin conexiones de tejido óseo. Ambas construcciones mostraron vasos marcados positivamente en la médula ósea, y el cartílago interno estaba rodeado por células osteoclásticas multinucleadas.
El mineral se depositó en la región osteoide externa de ambas construcciones con mayor volumen mineral y construcciones de AH debido a su mayor tamaño.
