Comience sumergiendo la retina de ratón dividida con membranas de nitrocelulosa adheridas en paraformaldehído al 4% sobre hielo durante 30 minutos. A continuación, reemplace el paraformaldehído con 5 a 10 mililitros de PBS a temperatura ambiente para lavar las retinas divididas. Antes de extraer la retina dividida de la nitrocelulosa, use un bolígrafo de barrera hidrofóbica para preparar pocillos circulares en un portaobjetos de microscopio.
Deje que los pozos se sequen al aire durante 5 a 10 minutos. Después, coloque las retinas divididas en los pocillos preparados y agregue suficiente PBS para sumergirlas. Bajo un microscopio de disección, levante suavemente los bordes del tejido con un pincel fino y haga un círculo alrededor de la retina para separarla de la membrana.
Use fórceps y el pincel para quitar la membrana de debajo de la pieza flotante de la retina. A continuación, aspire con cuidado el PBS restante, de modo que el tejido de la retina descanse sobre el microscopio con las células ganglionares hacia abajo. El marcaje de inmunofluorescencia de la sinaptofisina en la parte superior de la retina dividida indicó que los terminales sinápticos de los fotorreceptores estaban retenidos.
Sin embargo, los núcleos fotorreceptores estaban ausentes, lo que confirma que la retina se dividió a través de los axones fotorreceptores. La integridad sináptica se evaluó marcando RGS11 en dendritas ON-BC y CtBP2 en cintas sinápticas fotorreceptoras. La división no dañó la morfología de los terminales fotorreceptores en la capa plexiforme externa.
La viabilidad de los glóbulos rojos en la retina dividida se evaluó utilizando un tinte nuclear de infrarrojo cercano. Se observó variabilidad regional en la viabilidad celular a través del tejido, con una mayor muerte celular en algunas áreas, y la mayoría de los glóbulos rojos permanecieron viables después de la división. El marcaje por inmunofluorescencia de los glóbulos rojos frente a la PKC alfa y de las células horizontales frente a la calbindina-D mostró una rápida difusión de anticuerpos en la retina dividida después de una hora de incubación.
