Para comenzar, tome un capilar afilado, use una punta de microcargador para cargar de 2 a 10 microlitros del complejo de ribonucleoproteína CRISPR Cas9 o solución de control. Luego, coloque el capilar lleno en el manipulador del microinyector. Rompa la punta capilar con pinzas finas para ajustar el volumen de eyección a 10 nanolitros.
Coloque los embriones en etapa celular en una rejilla pegada en una placa de Petri de 100 milímetros con una solución de polisacarosa al 3%. Usando el micro inyector, y bajo un microscopio estereoscópico, inyecte 10 nanolitros de la solución en la región cortical, específicamente a nivel del polo animal debajo de la membrana citoplasmática. Después de 24 horas, visualice fluoresceína, lisina, dextrina bajo un microscopio estereoscópico fluorescente y seleccione embriones crujientes rho bien inyectados.
El marcaje de la caspasa 3 de las retinas de renacuajos rho crujientes mostró que algunos bastones sufren apoptosis. La tinción histológica reveló una preservación global de las capas nucleares, pero un acortamiento severo de los segmentos externos de los fotorreceptores. Un análisis adicional de la inmunotinción con marcadores fotorreceptores mostró la degeneración de los segmentos externos de los bastones.
