Comience la dilución de la muestra de suero humano mezclando cinco microlitros de la muestra de suero con 120 microlitros de tampón de ensayo en una placa de 96 pocillos. Diluir a ocho veces más mezclando 10 microlitros de la dilución inicial con 70 microlitros de tampón de ensayo. Ahora, prepare 100 microlitros de la mezcla de perlas que contiene perlas acopladas al antígeno objetivo.
A continuación, diluya la mezcla de perlas preparada en 2,4 mililitros del tampón de ensayo en un tubo Falcon. Comience la incubación del suero pipeteando 25 microlitros de la suspensión de perlas en los pocillos designados. Agregue 25 microlitros de suero diluido 200 veces en los pocillos con la suspensión de perlas.
Cubra la placa de reacción de 96 pocillos con un sello de microplaca. Luego incube el plato con perlas en un agitador de platos. Después de la incubación, retire la placa de reacción de 96 pocillos del agitador de placas.
Coloque la placa en una arandela de placa magnética y retire el sello adhesivo de la placa. A continuación, lave las perlas tres veces con 100 microlitros de tampón de lavado, luego aspire el volumen de lavado final de las perlas después del último paso de lavado. Para la primera incubación de anticuerpos, comience preparando una nueva mezcla de reactivos de detección dual de IgG e IgM en tampón de ensayo.
Pipetear 30 microlitros del reactivo de detección en cada pocillo designado, luego cubra la placa de reacción de 96 pocillos con un sello de microplaca. Incubar la placa en un agitador de placas durante 45 minutos a 20 grados centígrados a 750 revoluciones por minuto. Después de la incubación, coloque la placa en una arandela de placas magnética y retire la pipeta de sellado de placas adhesivas 30 microlitros de striptavidina diluida marcada con BV421 en cada reacción después de lavar las placas como antes.
A continuación, coloque la placa sellada en un agitador de placas para su posterior incubación. Una vez completada la incubación, lave la placa y vuelva a suspender las perlas dentro de los pocillos hasta un volumen final de 100 microlitros utilizando el tampón de lavado. Para analizar los resultados, cubra la placa de reacción de 96 pocillos con un sello de microplaca.
A continuación, incube la placa cubierta durante tres minutos a 20 grados centígrados a 1000 revoluciones por minuto en un agitador de placas. Transfiera la placa del agitador al instrumento analizador de flujo de doble reportero. Por último, evalúe la intensidad fluorescente media de la muestra, o IMF, siguiendo las instrucciones del fabricante.
El análisis de correlación de Spearman para tres antígenos representativos de Borrelia demostró una reproducibilidad uniforme de los valores de MFI al detectar anticuerpos anti-Borrelia presentes en sueros humanos. El ensayo reportero dual mostró una buena reproducibilidad ensayo a ensayo con una alta precisión entre ensayos demostrada por los gráficos de Levey-Jennings. A diluciones de muestra de 100 a 12.800 veces, las curvas de dilución tanto para la detección de IgM como para la detección de IgG fueron similares para ambos instrumentos.
Los valores de MFI fueron ligeramente superiores en el instrumento de reportero único.
