Para realizar la SPR para las interacciones VHL-MZ1, primero active el chip de estreptavidina según las instrucciones del fabricante: Para obtener la concentración más alta, agregue un tampón libre de DMSO al MZ1 para garantizar una concentración de DMSO del 2 %. Ahora pipetee 50 microlitros de la solución de mayor concentración en un pocillo que contenga 100 microlitros del tampón de funcionamiento. Mezcle bien para establecer la segunda concentración más alta.
Luego, transfiera 50 microlitros de la solución a los siguientes 100 microlitros de tampón corriente, mezcle bien para preparar la tercera concentración más alta, y así sucesivamente. Utilice láminas de plástico transparente autoadhesivas compatibles con microplacas de polipropileno para cubrir la placa. Inicie el SPR utilizando la configuración de varios ciclos.
Configure el modo en alto rendimiento, el tiempo de contacto en 120 segundos, el tiempo de disociación en 300 segundos y el caudal en 50 microlitros por minuto. Utilice el software de evaluación proporcionado por el fabricante del instrumento para ejecutar el análisis de datos. Para realizar la SPR para el complejo ternario VHL-MZ1-BRD4, primero active la estreptavidina.
Inyectar solución de VHL para inmovilizarla a aproximadamente 100 unidades de resonancia. Para el control negativo utilizando BRD4 solamente, prepare la concentración más alta de 25 micromolares en el tampón de funcionamiento con un volumen de 200 microlitros. A los siguientes cuatro pocillos, agregue 160 microlitros de BRD4 de dos micromolares.
Transfiera 40 microlitros del pocillo A5 al A4. Luego, pipetea el pocillo para mezclar bien. Del mismo modo, transfiera 40 microlitros del pocillo A4 al A3, continuando este proceso hasta llegar a A1. Para la formación de complejos ternarios con MZ1 y BRD4, pipetear 196 microlitros de solución BRD4 de 25,5 micromolares. A esto, agregue cuatro microlitros de MZ1 de 20 micromolares preparado en solución 100% DMSO.
Pipetear 160 microlitros de BRD4 a dos micromoles en el tampón de funcionamiento a los siguientes cuatro pocillos de la izquierda. A continuación, transfiera 40 microlitros del pocillo B5 al B4 y pipetee para mezclar bien. Continúe transfiriendo la solución de cada pocillo hasta B1. Ahora ejecute el SPR a la configuración de ciclo único con un tiempo de contacto de 100 segundos, un tiempo de disociación de 720 segundos y un caudal de 50 microlitros por minuto.
Se realizó la caracterización del complejo binario BVS-MZ1 y del complejo ternario BVS-MZ1-BRD4. Se observó una cooperatividad positiva. La caracterización del sistema de cerebro, PROTAC y PPM1D se realizó mediante SPR.
Los experimentos PPM1D utilizan un chip NTA de níquel, y la superficie del chip se regenera después de cada inyección de compuesto. BRD-2512, que solo se une al cerebro, y BRD-4761, que solo se une a PPM1D, muestran una respuesta de unión insignificante. BRD-5110 induce la formación de un complejo ternario entre PPM1D y muestra un efecto de gancho a altas concentraciones de compuestos.
