Para comenzar, prepare un medio de cultivo de organoides que contenga 10 micromolares Y-27632 y 2,5 micromolares CHIR-99021. Después de recubrir el ECM en el intestino en un chip, desconecte el tubo de salida del microcanal superior mientras mantiene abierto el tubo de derivación del microcanal superior. Con un clip de carpeta, asegure tanto la entrada como la salida del microcanal inferior.
Con una micropipeta P100, agregue 20 microlitros de la suspensión celular en el orificio de salida del microcanal superior. Asegure el tubo de derivación y entrada del microcanal superior con clips de aglutinante. Vuelva a conectar el tubo de salida al orificio de salida del microcanal superior, asegurándose de que el tubo permanezca abierto durante todo el proceso.
Una vez hecho esto, asegure gradualmente el tubo de salida del microcanal superior con un clip de carpeta. A continuación, bajo un microscopio, verifique que las células estén distribuidas uniformemente por todo el microcanal superior. Coloque el dispositivo de intestino en un chip y una incubadora de dióxido de carbono humidificado a 37 grados centígrados.
Conecte la jeringa conectada al microcanal superior del chip a una bomba de jeringa colocada dentro de una incubadora. Ajuste el caudal a 30 microlitros por hora e inicie el flujo continuo del medio de asiento para el microcanal superior. Durante este período, deje el microcanal inferior sujeto.
Al día siguiente del asiento, reemplace el medio con un medio de cultivo de organoides que contenga solo A-83-01. Una vez que se establece la monocapa para el microcanal superior, inicie el flujo continuo del medio de asiento hacia el microcanal inferior. A continuación, introduzca el medio de cultivo de organoides en los microcanales superior e inferior para iniciar el desarrollo de la morfogénesis tridimensional en el chip.
Aumente el caudal a 50 microlitros por hora para lograr una tensión pura de 0,02 por centímetro cuadrado en el diseño de tripa en un chip. Utilizando un biorreactor regulado por ordenador, aplique una cepa cíclica del 10% y una frecuencia de 0,15 hercios a las células cultivadas en un dispositivo de intestino en un chip durante dos o tres días para establecer la morfogénesis tridimensional. Después de seis a nueve días de flujo medio, se observó un agrupamiento ocasional de morfogénesis tridimensional de las células epiteliales intestinales caninas en todo el microcanal.
La tinción inmunofluorescente evaluó la estructura tridimensional de monocapas derivadas de organoides y estructuras similares a vellosidades en chips microfluídicos. La función de barrera intestinal medida por TEER mostró valores estables de TEER en el quinto día de cultivo.
