Se procede a realizar el análisis citométrico de flujo de la mitofagia de células beta, con una suspensión unicelular de unos 100 islotes espejados aislados preparados, correspondientes a cada condición experimental deseada a estudiar. Primero, vuelva a suspender las muestras de islotes para cada condición en 500 microlitros de medio de flujo de islotes. Agregue 0.25 microlitros de caldo de MtPhagy a los tubos designados para recibir el colorante de MtPhagy.
Del mismo modo, agregue 0,25 microlitros de caldo TMRE y caldo de fluozina-3-AM a los respectivos tubos designados. Envuelva los tubos en papel de aluminio y haga un vórtice de cada tubo a baja velocidad durante cinco segundos para mezclar el contenido. Luego incube los tubos a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
A la mitad de la incubación, haga vórtices de cada muestra a baja velocidad durante cinco a 10 segundos. Después de la incubación, centrifugar los tubos a 350 G durante un minuto a 10 grados centígrados. Deseche el sobrenadante.
Y resuspender las muestras en 500 microlitros de medio de flujo de islotes. Agregue DAPI a los tubos de microcentrífuga que contienen muestras que requieren tratamiento con DAPI. Centrifugar de nuevo y desechar el sobrenadante como se demostró anteriormente.
Resuspender el residuo en 500 microlitros de medio de flujo de islotes. Finalmente, coloque las muestras en hielo y luego proceda con la citometría de flujo. Ajuste los voltajes para la dispersión directa o FSC y la dispersión lateral o SSC para asegurarse de que las poblaciones celulares estén en el centro del diagrama de dispersión.
Para excluir los múltiples, en una puerta rectangular en la altura del FSC frente a la anchura del FSC, seguida de la altura del SSC frente a la anchura del SSC. Ajuste los voltajes y la compensación de DAPI para filtrar las células beta vivas. Establezca puertas de fluorescencia para cada fluoróforo utilizado en función de la muestra de RFD sin teñir.
Una vez que se establecen las puertas, recopile 10 000 eventos por muestra. Las células beta con alta utilización de mitofagia se definieron como la fluozina alta, la MtPhagy la alta TMRE baja población en el cuadrante tres o Q3. Se caracterizaron los niveles basales y de mitofagia inducidos por valinomicina en los islotes de RFD y HFD.
