Para evaluar la mitofagia en células beta pancreáticas murinas utilizando el indicador de mitofagia codificado genéticamente, se cultivaron islotes pancreáticos aislados de ratones de tipo salvaje y Mt-Keima durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, agregue 100 islotes en una placa de Petri de seis centímetros que contenga dos mililitros de medio de islote para cada condición experimental utilizada en este protocolo. A continuación, disociar los ojales en células individuales y teñirlos con FluoZin-3-AM y DAPI como se demostró anteriormente para el enfoque basado en el colorante Mt-Phagy.
A continuación, proceda con el análisis citométrico de flujo de las muestras. Ajuste los voltajes de dispersión directa o FSC y dispersión lateral o SSC para lograr una distribución uniforme de celdas en un gráfico SSCA versus FSCA. Para seleccionar celdas individuales y excluir múltiples, agregue una puerta rectangular en la altura FSC frente a la anchura FSC, seguida de la altura SSC frente a la anchura SSE.
Los multipletes se excluyen debido a sus valores de señal de ancho más altos. A continuación, configure una puerta negativa DAPI para excluir las células muertas. Después de eso, configure las puertas positivas de FluoZin-3-AM para filtrar las células beta vivas.
Establezca un esquema de compuerta triangular utilizando la muestra positiva de Mt-Keima para identificar poblaciones de células ácidas y neutras. Una vez establecidas las puertas primaria y de fluorescencia, se evaluó el flujo de mitofagia utilizando cambios basales e inducidos por valinomicina en la fluorescencia de Mt-Keima.
