Ensamblar la barrera hematoencefálica derivada de células madre pluripotentes humanas, o iBBB, utilizando las células endoteliales disociadas, parásitos y astrocitos, Combinar los tres tipos de células en un tubo cónico incluyendo un 10% más que el número calculado de células para tener en cuenta los errores de pipeteo. Girar la mezcla de células a 300 g durante tres minutos. Aspirar el sobrenadante, dejando el gránulo celular con aproximadamente 50 microlitros del medio.
Con una pipeta P200, vuelva a suspender suavemente el gránulo de células en el medio residual para crear una suspensión de una sola célula. Coloque el tubo que contiene la suspensión celular resultante sobre hielo y agréguele una cantidad suficiente de matriz de membrana basal GF reducida por el número deseado de iBBB. Mezclar las celdas de forma homogénea sin introducir burbujas de aire.
Pipetear 50 microlitros de la mezcla resultante de la matriz celular en un pocillo de una placa de cultivo con fondo de vidrio de 48 o 96 pocillos y distribuirla uniformemente por todo el fondo de la placa. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 30 a 40 minutos para polimerizar la matriz mientras se encapsulan las células. Finalmente, agregue 500 microlitros de medio astrocito suplementado al pocillo y mantenga los iBBB en cultivo.
Para una placa de 96 pocillos, agregue de 100 a 150 microlitros de medio al pocillo hasta que estén lo suficientemente desarrollados para los ensayos posteriores, que generalmente demoran dos semanas. El iBBB correctamente formado apareció como un único disco translúcido solidificado bajo un microscopio de campo claro. Después de 24 horas, se identificaron células individuales distribuidas uniformemente.
Después de dos semanas, se veían estructuras más distintas, aunque difíciles de definir.
