Comience descongelando los portadores de soluto congelados o los gránulos de células SLC en un baño de agua a temperatura ambiente. Prepare el tampón de solubilización combinando 135 mililitros de tampón base y tres comprimidos de cóctel inhibidor de la proteasa. Una vez disueltos los comprimidos, vuelva a suspender el gránulo en el tampón de solubilización.
Luego agregue desaminasa y transfiera la suspensión a un homogeneizador enfriado por hielo. Homogeneice la solución moviendo el émbolo hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 20 veces, manteniendo el homogeneizador en hielo. A continuación, agregue la solución de detergente a la concentración final al 1%.
Transfiera la mezcla de solubilización a un tubo cónico de 50 mililitros y gírela lentamente a cuatro grados centígrados. Después de una hora, centrifugar la mezcla y recoger el sobrenadante. Equilibre un volumen de lecho de cuatro a seis mililitros de resina Strep-Tactin con el tampón base.
A continuación, agregue resina equilibrada al sobrenadante solubilizado y gire durante dos horas a cuatro grados centígrados. Vierta la solución en una columna de flujo por gravedad y deje que la solución fluya a través de ella. Lave la resina con 30 veces el volumen de la cama de Strep Wash Buffer en tres pasos iguales.
A continuación, agregue de tres a cinco mililitros de tampón de ilusión e incube durante 15 minutos antes de recolectar el eluido. Mida la concentración de proteínas mediante espectroscopia absorbente UV. Combine las fracciones de ilusión deseadas y agregue la proteasa 3C.
Gire el tubo lentamente durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, equilibre de dos a cuatro mililitros de volumen de lecho de resina de afinidad de metal cobalto con tampón SEC. Agregue la resina de afinidad de metal cobalto equilibrada a la mezcla de reacción 3C durante la noche y gírela a cuatro grados centígrados.
Después de una hora, vierta la solución en una columna de flujo por gravedad y recoja el flujo. Concentre el flujo en un filtro centrífugo de corte de 100 kilodalton girando a 3000 g a cuatro grados centígrados. Columna SEC equilibrada basada en argos de dextrano con búfer SEC.
Inyecte la muestra en el circuito de muestra y ejecute el programa SEC con un caudal, de modo que la presión de la columna esté por debajo de las especificaciones del fabricante de la columna. Usando un colector de fracciones, recoja 300 fracciones de microlitros durante toda la ejecución de la SEC. Después de agrupar las fracciones de pico, mida la absorbancia a 280 nanómetros.
A continuación, concentre las muestras hasta el volumen requerido en un filtro de corte de 100 kilodalton. La expresión inicial de la proteína SLC a pequeña escala se analizó mediante electroforesis de página SDS. La microscopía de fluorescencia de A GFP marcada con SLC, confirmó la localización de la proteína, específica de la membrana plasmática con acumulación intracelular significativa.
La proteína química y estructuralmente homogénea produjo un único pico monodisperso de A280 durante la cromatografía de exclusión por tamaño.
