Para comenzar, agregue 30 gramos de cloruro de sodio en seis litros de agua desionizada en un tanque de líquido de vaina y agite el tanque para disolver la sal. A continuación, conecte el tanque a un clasificador de celdas. Encienda el clasificador de células, inicie el sistema fluídico y espere a que los fluídicos se equilibren.
Configura el retardo de caída. Para preparar la solución madre de extracto de levadura, vuelva a suspender una alícuota de extracto de levadura de carbono 13 en 7,5 mililitros de agua ultrapura y 2,5 mililitros de metanol. Luego, para preparar el tampón de extracción, agregue 10 microlitros de solución madre de extracto de levadura de carbono 13 a 10 mililitros de acetonitrilo y mezcle bien.
Agregue 25 microlitros del tampón de extracción a cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos y cubra los pocillos con una tapa. Coloque la placa en el clasificador de celdas para recolectar las celdas clasificadas. Ordene 5000 eventos de cada una de las poblaciones positivas para Alexa Fluor 647 y negativas para PE en los primeros cuatro pozos.
A continuación, clasifique 5000 eventos de cada una de las poblaciones positivas de PE y Alexa Fluor 647 negativas en los siguientes cuatro pozos. A continuación, para las células madre hematopoyéticas, clasifique 5000 eventos de la población baja de PE-Cy7, PE positiva, APC-Cy7 positiva, Violeta brillante 605 positiva y Violeta brillante 421 negativa en el primer pocillo, seguido de la clasificación de 5000 eventos de la población PE-Cy7 baja, PE positiva, APC-Cy7 positiva, violeta brillante 421 positiva y violeta brillante 605 negativa en el siguiente pocillo. En el caso de las muestras de escombros, seleccione eventos demasiado pequeños para representar celdas intactas en función de las señales de dispersión hacia adelante y hacia los lados.
A continuación, encienda el instrumento LC-MS. Coloque la placa de muestra en el muestreador automático del instrumento. Abra el software compatible con LC-MS y prepare el instrumento para el análisis.
Ejecute al menos cuatro muestras en blanco o en grupo de proceso para equilibrar la columna y una mezcla de prueba de LC para verificar el rendimiento cromatográfico. Confirme que la contrapresión inicial y máxima sea inferior a 150 y 400 bar respectivamente. A continuación, asegúrese de que los tiempos de retención se encuentren dentro de una ventana de un minuto.
A continuación, verifique que el valle entre la leucina y la isoleucina en la transición positiva de 132 a 86 sea inferior al 20% de la altura máxima. Por último, asegúrese de que la diferencia en el tiempo de retención de AMP a ADP sea de 1,5 a 1,9 minutos y de ADP a ATP sea de 1,1 a 1,5 minutos. Después de confirmar los parámetros experimentales, configure una ejecución con una muestra en blanco de proceso o de grupo para minimizar el arrastre de la mezcla de prueba de LC, seguida de las muestras de prueba en orden aleatorio.
La clasificación FACS permite aislar poblaciones puras de diferentes tipos celulares a partir de la misma suspensión celular. Las diferencias metabólicas entre los tipos de células del mismo tejido se conservaron utilizando el protocolo CMS de células FACS para células madre hematopoyéticas y progenitoras multipotentes. Se requirieron células de seis ratones para generar seis muestras, lo que llevó a una mayor variabilidad dentro de cada grupo en comparación con las células B y T, que se clasificaron del mismo bazo murino.
Las muestras de escombros que representaban las muestras de control en blanco del proceso se separaron claramente de las muestras que contenían extractos celulares. Aquí se muestra un mapa de calor que muestra información sobre los niveles relativos de metabolitos en diferentes tipos de células.
