Para empezar, se cultivaron hiPSCs en medio de mantenimiento IPSC en una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos recubierta con gel de matriz extracelular reducida en factor de crecimiento. Cuando las células alcancen el 80 al 90 % de v, retire el medio de la placa y lave las células una vez con DPBS. A continuación, añadir de 700 a 800 microlitros de EDTA 0,48 milimolar e incubar durante un minuto a temperatura ambiente.
Retire la solución de digestión e incube la placa a 37 grados centígrados durante tres a cinco minutos. Cuando las células se digieren en láminas, agregue dos mililitros de medio de mantenimiento IPSC para terminar la digestión. Transfiera la suspensión de la celda a una placa de fijación baja de seis pocillos.
Incubar las células a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono y 60 RPM para formar cuerpos embrionarios esféricos o EB. Después de 24 horas, con una pipeta pasada, transfiera los EB al tubo de centrífuga y déjelo sedimentar durante cinco a 10 minutos antes de eliminar el sobrenadante. Agregue el medio de diferenciación MSC al tubo y transfiera los EB a una cuchilla de fijación baja de seis pocillos con dos mililitros de medio de diferenciación MSC.
Cultive los EB en el agitador a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante siete días. Al octavo día, transfiera los EB al tubo de centrífuga como se demostró anteriormente. Una vez que los EB estén sedimentados, retire el sobrenadante del tubo.
Agregue el medio de mantenimiento MSC en el tubo y transfiera los EB a una placa de seis pocillos recubierta de gel de matriz extracelular reducida en factor de crecimiento con dos mililitros de medio de mantenimiento MSC. Después de la adhesión celular, cambie el medio hasta que el cultivo alcance un 90% de confluencia. A continuación, trate el cultivo derivado de EB con una solución de disociación a 37 grados centígrados.
Cuando parte de las células se digieren en células individuales, agregue dos mililitros del medio de mantenimiento MSC para terminar la digestión y transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga. Lave las células restantes no digeridas de los pocillos una vez con DPBS. Y digerir de nuevo como se demostró anteriormente.
A continuación, centrifugar la suspensión celular a 250 g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y siembre las células en una placa de cultivo recubierta de gelatina. Cultive las células en medio de mantenimiento MSC al 90% de confluencia con un cambio regular del medio.
Líneas de cultivo hiIPCs como se ha demostrado anteriormente. Cuando las celdas alcancen una confluencia del 50 al 60%, retire el medio de mantenimiento IPSC de la placa. Añade dos mililitros de medio de mantenimiento MSC.
Y cultivo durante 14 días a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono con cambio diario del medio. Para la maduración de las MSC, tratar el cultivo monocapa con una solución de disociación a 37 grados Celsius. Cuando parte de las células se digieren en células individuales, agregue dos mililitros del medio de mantenimiento MSC en los pocillos para terminar la digestión y transferir la suspensión celular a un tubo de centrífuga.
Lave las células restantes no digeridas una vez con DPBS y digiera como se demostró anteriormente. A continuación, centrifugar la suspensión celular como se demostró anteriormente y sembrar las células en una placa de cultivo recubierta de gelatina. Cultive las células en medio de mantenimiento MSC al 90% de confluencia con un cambio regular del medio.
En el método de formación de EB, las colonias de hiIPCs exhibieron una morfología compacta antes de la diferenciación. Después de la disociación, se formaron EB esféricas uniformes, que aumentaron de volumen con el tiempo. Posteriormente, las EB se transformaron en células monocapa adherentes alcanzando un 90% de confluencia en el día 18 y adquiriendo una morfología en forma de huso después de dos pasadas.
Del mismo modo, en el método de la monocapa, las células proliferaron formando células adherentes multicapa. Después de empaquetarse varias veces, las células maduraron en MSC con una forma de huso típica y una colonia arremolinada. El análisis de citometría de flujo reveló que los hiIPC fueron positivos para CD90 y negativos para CD34, CD45, CD105 y CD73.
Después de la diferenciación, los hiIPC que impulsaron las MSC expresaron CD90, CD73 y CD105, mientras que permanecieron negativos para CD34 y CD45. Las MSC derivadas de monocapa mostraron una mayor formación de depósitos de calcio que el método EB. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en las capacidades de diferenciación adipogénica y condrogénica.
Las capacidades de proliferación de ambos métodos se mantuvieron hasta por 20 pasajes.
