Comience modificando químicamente las fracciones proteicas agrupadas a través de la metilación reductiva. Para ello, tome la proteína purificada y agréguele 20 milimolares de dimetilamina borano, seguido de 40 milimolares de formaldehído. Incubar la mezcla en un agitador oscilatorio durante dos horas a cuatro grados centígrados.
Luego, agregue 10 milimolares adicionales de borano de dimetilamina a la mezcla. A continuación, incube la mezcla durante la noche durante 12 a 18 horas a cuatro grados centígrados. Apague la reacción agregando cloruro de tris 100 milimolares con un pH de 7.5.
Utilice el tampón de lavado y el tampón de elución adecuados para cargar la proteína metilada en una columna de níquel-NTA. Primero, lave la columna de níquel-NTA de dos mililitros con 10 volúmenes de columna de tampón de lavado. Y luego, eluir la proteína con el tampón de elución.
Después de la elución, pase la proteína eluida a través de una columna de desalinización de PD-10, preequilibrada con el tampón adecuado. Agregue colesterol preparado en isopropanol o etanol a la proteína desalinizada e incube la mezcla durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, ultracentrifugar la mezcla a 150.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Agregue el sobrenadante recolectado a un concentrador centrífugo con un corte de 100 kilodalton y concentre el sobrenadante a una concentración final de 30 a 50 miligramos por mililitro. Una vez más, centrifuga la proteína concentrada con una centrífuga refrigerada de sobremesa de alta velocidad y retira el gránulo. Coloque el sobrenadante recolectado sobre el hielo a cuatro grados centígrados antes de proceder a fijar la cristalización.
Las proteínas alquiladas almacenadas a cuatro grados centígrados se analizaron mediante cromatografía analítica de filtración en gel en el transcurso de un mes. Y mostró una ligera pérdida de proteínas después de una semana.
