Para empezar, utilice una incubadora y un iluminador de microplacas LED para crear una caja de luz para controlar la exposición a la luz y la temperatura. Luego, coloque una placa de seis pocillos en el estante superior de la incubadora y verifique si el haz de luz la abarca uniformemente. Utilice una hoja de papel para visualizar la distribución de la cobertura de luz.
Utilice un medidor de luz para medir la irradiancia y la uniformidad espacial. Al menos un día antes de las inyecciones, prepare platos de inyección y platos de seis pocillos recubiertos de agarosa. Enjuague un molde de plato de inyección con medio embrionario y colóquelo suavemente sobre la muda y la agarosa.
Una vez que la agarosa se haya solidificado, use delicadamente la lengüeta para quitar el molde. A continuación, prepare pipetas de vidrio flameado para experimentos de inmunofluorescencia en embriones declorados. Coloque el extremo de una pipeta de vidrio en un bollo y la llama del quemador, y gírelo continuamente hasta que los bordes se vuelvan lisos.
Prepare una mezcla de inyección utilizando los ARNm que se muestran aquí. Para el ensayo de fenotipado, introduzca la aguja a través del corion directamente en el centro de la célula en la etapa de una célula e inyecte un nanolitro de la mezcla de inyección. Si se realiza un ensayo de inmunofluorescencia, diríjase al centro de la célula de los embriones recubiertos en la etapa de una célula.
Para ambos ensayos, prepare suficientes embriones para los embriones no expuestos, no expuestos, no expuestos, no inyectados, expuestos, inyectados. Seleccione al menos 30 embriones por condición. Para el ensayo de inmunofluorescencia, prepare una placa adicional que contenga embriones no inyectados como proxy para evaluar la progresión de las etapas de desarrollo.
Después de la inyección, incubar los embriones en placas de Petri a 28 grados centígrados.
