Evaluation of bOpto-BMP/Nodal Expressing Embryos After the Light Exposure Experiment

Para el ensayo de fenotipado, realice el experimento de exposición a la luz en embriones de pez cebra que expresen bOpto-BMP bOpto-Nodal y retírelos de la caja de luz un día después de la fertilización entre 24 y 32 HPF. Utilizando un telescopio de disección, evalúe los fenotipos y establezca una rúbrica de puntuación. Evalúe los embriones mientras permanecen dentro del corion por conveniencia.

Utilice una pipeta para sondear y reposicionar los embriones para verlos desde diferentes ángulos. Para el ensayo de inmunofluorescencia, después de incubar los embriones en formaldehído al 4% a cuatro grados centígrados durante la noche, retire el formaldehído y enjuáguelos de tres a cinco veces con PBST. Deseche el PBST y agregue metanol al 100%.

Selle los tubos e inviértalos suavemente para mezclar PBST residual y metanol. Después de lavar los embriones dos veces más con metanol, guárdelos a menos 20 grados centígrados durante al menos dos horas hasta varios años. Utilizando un microscopio equipado para cortes ópticos, capture imágenes de embriones inmunoteñidos.

Los experimentos de tinción inmunofluorescente con cantidades adecuadas de ARNm y condiciones de exposición a la luz mostraron que los niveles de pSmad eran similares y no se inyectaron en embriones no expuestos, mientras que los embriones expuestos a la luz inyectados exhibieron niveles más altos de fosforilación de Smad.