Para comenzar, cultive las células en medio completo DMEM que contenga 10% de FBS y 5% de penicilina-estreptomicina en una placa de seis pocillos. Incubar el cultivo durante una noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, co-cultivar las células con 10 nanopartículas nanomolares de óxido de hierro modificado con polilisina o IONPs, e incubar a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 12 horas.
Después de la incubación, agregue 0,5 mililitros de tripsina por pocillo durante tres minutos para digerir las células. Luego agregue un mililitro de Medio Completo por pocillo para detener la digestión. Centrifugar la suspensión celular a 1.000 g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante antes de volver a suspender el gránulo en PBS.
A continuación, vuelva a suspender el gránulo en ocho mililitros de solución hipotónica recién preparada durante 15 minutos. Transfiera la suspensión celular a un tubo de ensayo de vidrio y, con un homogeneizador de vidrio, aplique 20 descargas a 1, 000 RPM para liberar los orgánulos. Después de la homogeneización, transfiera un mililitro de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Coloque el tubo en un separador magnético durante una hora para separar completamente los endosomas cargados de IONP de otros orgánulos y desechos celulares. Para recolectar endosomas, deseche el líquido del tubo y agregue tres mililitros de PBS para volver a suspender los endosomas. A continuación, utilice una pistola de pipetas para soplar y volver a suspender los gránulos marrones que se encuentran en la superficie de contacto del tubo junto al marco magnético.
Para una homogeneización de alta velocidad, transfiera la solución del endosoma a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Coloque la nevera debajo del tubo y luego coloque el tubo en el homogeneizador de alta velocidad. Coloque la sonda de 10 mililitros en el tubo sin tocar el fondo.
En la pantalla del homogeneizador, ajuste la velocidad a 140 g y ajuste el tiempo a cinco minutos. Presione el botón OK seguido del botón Inicio. Después de la homogeneización a alta velocidad, transfiera la suspensión de nanovesículas a un tubo de 1,5 mililitros y coloque el tubo en un separador magnético durante una hora.
Finalmente, recoja el líquido que contiene los imitadores de exosomas o EM requeridos sin perturbar la superficie junto al marco magnético. La morfología de los BMSC-EMs analizados por NTA y TEM mostró una estructura típica en forma de vesícula en forma de cuenco, delimitada por una bicapa lipídica. Tanto los BMSC-EM como los 293T-EM tenían un diámetro hidrodinámico similar al de los vehículos eléctricos nativos.
Los resultados de Western blot mostraron que los BMSC-EM contienen los mismos biomarcadores proteicos que los EV y casi no tienen contaminación de la membrana plasmática. El rendimiento de EMS fue significativamente mayor que el de los vehículos eléctricos nativos preparados por ultracentrifugación. Los ME tenían una composición proteica similar a la de los VE nativos.
