Removal of Debris and Red Blood Cells from CNS Cell Suspension of EAE Mice

Para comenzar, obtenga un gránulo celular después de la disociación del tejido del SNC y vuelva a suspenderlo con 3, 100 microlitros de DPBS en un tubo de 15 mililitros. No haga vórtices. Agregue 1.800 microlitros de la solución de eliminación de residuos del kit de disociación cerebral adulta a dos suspensiones de células del SNC combinadas.

Invierta el tubo y mezcle la suspensión, luego cúbralo suavemente con 4 mililitros de DPBS frío y observe un gradiente claro. Centrifugar los tubos durante 10 minutos a 3.000 g a 4 grados centígrados con aceleración máxima y sin descanso. Después de la centrifugación, se forman tres fases.

Aspire las dos fases superiores por completo y deséchelas, asegurándose de que no queden residuos de mielina. Llene el tubo con DPBS frío hasta 14 mililitros y ciérrelo. Invierta el tubo con fuerza sobre el banco de trabajo hasta que el gránulo de la celda se desprenda del fondo del tubo.

Centrifugar la muestra y aspirar el sobrenadante por completo. Para la extracción de glóbulos rojos, agregue 1 mililitro de la solución de extracción de glóbulos rojos al gránulo de células. Después de volver a suspender el gránulo, incubar la solución durante 10 minutos a 4 grados centígrados.

Luego agregue 10 mililitros de tampón PB frío, centrifugue la muestra y aspire completamente el sobrenadante. Para el recuento celular, diluya la suspensión celular 50 veces en tampón PB y luego de 1 a 10 diluciones en una solución de azul de tripano al 0,4%. A continuación, determine el recuento de células, utilizando una cámara de recuento mejorada.