Para empezar, coloque las placas de alto rendimiento esterilizadas por UV y las alícuotas de trombina en la campana de cultivo de tejidos. Coloque la mezcla de fibrina celular preparada en hielo para retrasar la coagulación. Con una pipeta P20, extraiga seis microlitros de la mezcla de fibrina celular.
A continuación, coloque suavemente la punta de la pipeta en la alícuota de trombina y mezcle dos veces sin introducir burbujas de aire. Levante la placa de alto rendimiento en ángulo e inserte rápidamente la punta de la pipeta en uno de los puertos de carga. Empuje el émbolo de la pipeta hasta el primer tope con un movimiento suave y fluido e inyecte la mezcla de fibrina celular en la cámara de tejido.
Asegúrese de que el gel atraviese completamente la cámara. Coloque suavemente la placa plana sin quitar la punta de la pipeta ni desplazarla. Retire la punta de la pipeta con una mano del P20 y déjela en el orificio del puerto de carga.
Después de dos minutos, retire las puntas de pipeta con suaves movimientos giratorios de los puertos de carga y coloque la tapa en la placa. Incubar la placa durante 15 a 20 minutos a 37 grados centígrados para la polimerización en gel. Coloque el dispositivo microfluídico en la platina del microscopio para observar la distribución uniforme de las células por toda la cámara sin burbujas de aire.
Inserte la punta de pipeta P20 en M1 o M3 y expulse lentamente cuatro microlitros de laminina para recubrir todo el panel superior. Retire la punta de la pipeta como se ha demostrado anteriormente e incube la placa a 37 grados centígrados con un 5 % de dióxido de carbono durante 10 minutos. Agregue 275 microlitros de medios completos EGM-2 a los depósitos desacoplados de los pocillos ubicados en las filas A y B. Inserte la punta de pipeta P200 en el orificio de entrada de medios de los pocillos que contienen 275 microlitros de EGM-2 y expulse lentamente 75 microlitros de medio, observando cómo el medio viaja a través del canal y burbujea por el otro lado.
Después de retirar la punta de la pipeta, empuje el medio restante de la punta hacia el depósito del medio. Agregue 50 microlitros de medio para cubrir completamente los pocillos del lado bajo en las filas G y H. Incube las placas durante una o dos horas como se demuestra. Bajo un microscopio, identifique cualquier burbuja en los canales de medios y elimínelas reintroduciendo 75 microlitros de medios en los canales.
Compruebe a simple vista las entradas o salidas medianas en busca de burbujas de aire. A continuación, inserte la punta de la pipeta P200 en el orificio y extraiga la burbuja levantando el émbolo. En los microórganos vascularizados o VMO, las células endoteliales inicialmente se distribuyeron uniformemente dentro de la cámara de tejido, pero al segundo día, comenzaron a estirarse y luminizarse.
Al cuarto día, las células endoteliales se anastomosaron con los canales microfluídicos externos, formando una red vascular continua. La función de barrera vascular ajustada se confirmó mediante la perfusión de FITC-dextrano a través de la red microvascular con fugas mínimas. La perfusión de células cancerosas MDA-MB-231 en las VMO dio lugar a su adherencia al revestimiento endotelial y a la posterior extravasación al espacio extracelular, formando múltiples micrometástasis dentro de las 24 horas posteriores a la perfusión.
A través de imágenes microscópicas de lapso de tiempo, se observó la extravasación de las células T en el espacio extracelular de los VMO durante 45 minutos. En los microtumores vascularizados con vasos completamente formados, las células T se adhirieron rápidamente a la pared vascular tras la perfusión.
