Para comenzar, retire el epiplón humano recién extirpado del recipiente de recolección dentro de una campana de flujo laminar. Sumerge el epiplón en PBS para lavar suavemente cualquier residuo de sangre o residuos. Con un bisturí y unas pinzas, corte el tejido en trozos.
Coloque los trozos de epiplón en pocillos individuales de una placa de cultivo de 24 pocillos. A continuación, llene los pocillos con 500 microlitros de medios de cultivo de epiplón. Agregue 10 mililitros de PBS estéril a un matraz de cultivo que contenga un 75 % de células de cáncer de ovario mCherry humanas confluentes positivas.
Balancee suavemente el matraz para lavar las células. Retire el PBS y agregue tres mililitros de 0.05% de tripsina EDTA. Vuelva a mecer suavemente el matraz de cultivo para distribuir uniformemente la tripsina EDTA en las células adheridas.
A continuación, coloque el matraz en una incubadora durante cinco minutos a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono. Después de eso, retire el matraz de la incubadora. Ahora golpee el matraz de cultivo para separar completamente las células.
A continuación, añade tres mililitros de medio de cultivo de epiplón para neutralizar la tripsina. Pipetea la suspensión celular varias veces para mezclarla bien. Transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 mililitros.
Centrifugar la suspensión a 1.200 G durante cinco minutos a 24 grados centígrados. A continuación, pipetear el sobrenadante y volver a suspender el gránulo celular en seis mililitros de medio de cultivo de epiplón fresco. Tome 10 microlitros de la suspensión celular para contar las células usando un contador de células.
Diluir la suspensión celular con medios de cultivo frescos hasta la densidad requerida. Con una jeringa de un mililitro, extraiga la suspensión de células cancerosas. Coloque una aguja de calibre 26 en la jeringa.
Ahora use un par de pinzas quirúrgicas pequeñas para recoger un pedazo del epiplón cortado y colóquelo en un plato estéril de trabajo separado. A continuación, inyecte unos 100 microlitros de la suspensión de células cancerosas en el tejido. Alternativamente, mezcle volúmenes iguales de matriz de membrana basal descongelada con cultivo de epiplón.
Coloque la mezcla sobre hielo hasta la inyección. Después de sumergir los trozos de epiplón en la mezcla de matriz en los pocillos de la placa de cultivo, incubar la placa durante 20 minutos. Después de eso, retire la placa de la incubadora.
Una vez que la mezcla se haya solidificado, inyecte los trozos de epiplón con las células cancerosas. Confirme la inyección exitosa de las células cancerosas mediante imágenes fluorescentes. Se puede ver una raya de señal fluorescente en los sitios de inyección como confirmación.
Para facilitar el cocultivo del epiplón y las células cancerosas, agregue de 500 a 200 microlitros de medios frescos cada 48 a 72 horas. Por último, con un microscopio fluorescente, controle el crecimiento de los tumores de cáncer de ovario. El crecimiento del tumor puede ser visible en dos semanas.
Las células de cáncer de ovario se integraron con éxito en los trozos de epiplón el día 14. Las células cancerosas se diseminaron inicialmente a través de la superficie del epiplón en la primera semana. Con el tiempo, las células se congregaron para formar tumores.
La carga tumoral se confirmó por el cambio de color del epiplón medio, que pasó de rojo a amarillo.
