Para comenzar, enjuague las larvas de Drosophila en etapa L3 tres veces durante cinco minutos cada una en PBS frío. Con dos pares de pinzas afiladas, sostenga la parte anterior de las larvas y retire aproximadamente 2/3 de los tejidos del cuerpo. Sostenga el primer 1/3 de las larvas con un par de pinzas y ganchos bucales con el otro par.
Luego retraiga los ganchos bucales dentro de las larvas hasta que las larvas estén completamente invertidas. Retire los discos de las patas y el cerebro para obtener un cadáver larvario invertido limpio con un par de discos alares unidos a la tráquea. Transfiera los discos de las alas a un tubo de centrífuga de un mililitro.
Fijar los discos de las alas en paraformaldehído al 4% diluido en PBS durante 45 minutos a temperatura ambiente bajo agitación. Después de la fijación, lavar las muestras tres veces durante cinco minutos cada una con etanol al 70%. Retire las cabezas, el abdomen, las patas y las alas de las moscas anestesiadas y coloque los tórax disecados en PBS frío.
Prefijar el tórax en paraformaldehído al 4% diluido en Tritón al 1% durante 20 minutos bajo agitación. A continuación, lave las muestras tres veces durante cinco minutos cada una con PBT bajo agitación. Coloque los tórax en una cinta adhesiva de doble cara en un portaobjetos de vidrio y córtelos en dos con una cuchilla de micrótomo afilada para producir dos hemitórax.
Fijar los hemithoratos en paraformaldehído al 4% durante 45 minutos bajo agitación. Lave las muestras dos veces durante 20 minutos cada una con PBT bajo agitación. Coloque los hemitóranos en PBS frío y use fórceps para aislar cuidadosamente los músculos de vuelo indirecto de los hemitórax.
Permeabilizar los músculos en etanol al 70% durante dos a siete días a cuatro grados centígrados. Después de la permeabilización, lave los IFM dos veces durante 20 minutos cada uno con el tampón A. Luego agregue 400 microlitros del tampón de hibridación y prehibrida los músculos durante 30 minutos a 37 grados centígrados en un mezclador térmico. Añadir 100 microlitros de tampón de hibridación recién preparado que contenga la sonda y el anticuerpo primario.
Incubar las muestras en la oscuridad a 37 grados centígrados durante 16 horas a 300 RPM en un mezclador térmico. Después de la incubación, lave las muestras tres veces con tampón A tibio durante 10 minutos cada una. A continuación, incubar las muestras en anticuerpo secundario y DAPI diluido en tampón A a 37 grados centígrados durante una hora.
Lave las muestras tres veces con tampón B durante 20 minutos cada una antes de transferirlas a un portaobjetos de microscopio. Limpie el tampón residual B y agregue 30 microlitros de medio de montaje en el portaobjetos. Coloque un cubreobjetos de 18 por 18 milímetros en el portaobjetos y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas.
