Para empezar, vierte 100 mililitros de agua destilada en un vaso de precipitados que contenga 4 gramos de azúcar y 0,8 gramos de agar. Calienta la mezcla a 100 grados centígrados mientras remueves continuamente. Retira la mezcla del fuego para que se enfríe.
Baja el fuego para mantener una temperatura de 80 grados centígrados. Luego, agregue 7,4 gramos de harina, seguidos de 2,8 gramos de levadura a la mezcla mientras revuelve. A continuación, agregue la solución de ácido propiónico Moldex a la mezcla, luego enfríe la temperatura a 50 grados centígrados.
Agregue la solución de extracto de la planta de psidium guajava seguida de 0,5 gramos de polvo de azul de bromofenol. Vierta la mezcla de alimentos preparados en placas de Petri hasta que cada plato esté lleno. Después de que los platos se hayan enfriado a temperatura ambiente, séllelos con sus tapas y guárdelos en un refrigerador a 4 grados centígrados.
Para preparar los viales para la prueba, primero prepare los tanques de dióxido de carbono, la pistola de aire comprimido de dióxido de carbono con agujas, la almohadilla para moscas, el pincel y el microscopio para manipular las moscas. Seleccione viales que contengan al menos 10 pupas de Drosophila para estandarizar la edad de las moscas. Para eliminar las moscas adultas, invierta los viales e inserte una aguja entre el tapón de algodón y la pared lateral del vial.
Anestesiar a las moscas adultas con la cerbatana de dióxido de carbono hasta que queden inconscientes sobre el tapón de algodón. Abra el frasco sobre una botella de vidrio que contenga etanol al 70% y deje caer las moscas en él. Selle el vial con el tapón de algodón.
Luego, incubarlo a 25 grados centígrados con un 60% de humedad y un ciclo de luz de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. A continuación, clasifique las moscas en hembras y machos vírgenes con la ayuda de un microscopio dentro de las ocho horas posteriores a la incubación para evitar el apareamiento. Los genitales femeninos se pueden identificar por su color pálido, mientras que los genitales masculinos tienen un tono rojizo.
Los machos también pueden ser reconocidos por los peines sexuales en sus patas delanteras. Divida las moscas clasificadas en dos tubos frescos, uno para cada sexo, e incube durante 6-8 días a 25 grados centígrados. Comience apilando placas de Petri etiquetadas una encima de la otra.
Invierte las placas de Petri con los alimentos teñidos en papel secante para absorber el exceso de líquido. Luego, use una espátula para dividir la comida en cada plato en 12 segmentos iguales. Transfiera una rebanada de comida a una placa de Petri vacía.
A continuación, anestesia a las moscas con dióxido de carbono hasta que se duerman en el tapón de algodón. Transfiera con cuidado seis moscas sanas a cada placa de Petri. Coloque los platos sellados en una incubadora.
Para evitar que las moscas se escapen durante el experimento, asegure las cubiertas superior e inferior de cada placa de Petri con cinta adhesiva. Después de un período de cría de 24 horas, anestesiar a las moscas nuevamente con dióxido de carbono. Luego, transfiera las moscas a un recipiente lleno de etanol al 70% para su eliminación.
Además, deseche cualquier resto de comida de los platos. Para facilitar la cuantificación de las placas de Petri, inicie el software Epson Scan 2, asigne un nombre de archivo y realice una vista previa del escaneo. Escanee individualmente las cubiertas superior e inferior de cada placa de Petri.
Recorte cuidadosamente el escaneo a imágenes con un editor de imágenes de código abierto para eliminar cualquier artefacto y residuo de comida, luego guarde la imagen recortada como un archivo TIFF. A continuación, inicie el software T.U.R.D.. Haga clic en Archivo para crear un nuevo documento de experimento, asígnele un nombre y guárdelo en la subcarpeta Análisis.
Haga clic en la opción Placas y luego seleccione Agregar placa para elegir la placa de Petri para el análisis. Aparecerá una nueva ventana que muestra los nombres de las placas seleccionadas junto con la nueva configuración de parámetros. Establezca el tamaño del bloque en 21, el desplazamiento en 5, el tamaño mínimo en 20 y el tamaño máximo en 600.
Para confirmar la precisión de la detección de depósitos fecales, vaya a Placas y luego haga clic en Inspeccionar placas seleccionadas seguido de Gráficos y Ver imágenes anotadas. Acérquese a las imágenes para revisar los recuentos de depósitos. Si es necesario, anule la selección de los depósitos que no deban incluirse en el análisis.
Después del análisis con el software T.U.R.D., ajuste el número de moscas haciendo clic en el número de moscas. Cambie el nombre del grupo haciendo clic en Placas, seguido de Editar grupos, luego presione Agregar. Seleccione el nombre de grupo apropiado en la columna Grupo.
A continuación, haga clic en Analizar, seguido de Estadísticas descriptivas y seleccione Agrupar para exportar los datos de cada réplica por separado. Guarde todos los archivos de hoja de cálculo resultantes en la misma carpeta designada. Para compilar todos los datos en una sola hoja de cálculo, abra la aplicación Excel Merge v4.
Cuando se le solicite que seleccione la ruta de la carpeta con archivos CSV, ingrese la dirección de la carpeta y presione Intro dos veces para crear una nueva hoja de cálculo en la misma carpeta. Agregue una nueva hoja en la hoja de cálculo con los datos combinados para calcular la media de cada parámetro en todas las réplicas. Utilice la función BUSCARV para recopilar la media de cada parámetro de todas las réplicas.
Inicie el software GraphPad Prism e ingrese los nombres de los conjuntos de datos. Transfiera los datos de la hoja de cálculo de Excel al gráfico de datos de Prism. Haga clic en Analizar para elegir los conjuntos de datos para el análisis y presione Aceptar. Elija los parámetros de prueba apropiados, analice el valor P.
El número de depósitos fecales, el área total de los depósitos y la IOD fueron significativamente mayores en el grupo de alimentos normales en comparación con el extracto de P. guajava tanto en machos como en hembras vírgenes. El seguimiento del consumo de alimentos sólidos mostró que no hubo diferencias significativas en el consumo de alimentos entre los grupos suministrados y no suministrados por fármacos. Sin embargo, las moscas macho que consumieron loperamida parecieron ingerir menos comida de lo normal.
