Para empezar, siembre las células DAKIKI en una placa de seis pocillos a una densidad de seis millones de células por pocillo. Montar los diferentes grupos experimentales, y tras el tratamiento correspondiente, basado en el método de agrupamiento, incubar las placas durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Extraiga el ARN total de las células DAKIKI, siguiendo las instrucciones del kit de extracción de ARN total.
Tome un microlitro del ARN extraído de cada grupo de muestras para medir su concentración. Transcriba inversamente un microgramo de ARN total de cada muestra en ADN complementario, siguiendo las instrucciones del kit. Realizar la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa, o amplificación RT-PCR para detectar la expresión de cada gen.
Para el Western blot después de la incubación inicial de 24 horas, recoja las células de cada grupo. Agregue un volumen apropiado de solución de lisis celular a las células recolectadas antes de incubarlas en hielo durante 30 minutos. Centrifugar las muestras a 13,500 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y recoger el sobrenadante para su posterior análisis.
Agite las muestras de proteínas con un tampón de carga 5X SDS-PAGE en una proporción de cuatro a uno y caliente las muestras mezcladas a 100 grados Celsius durante cinco minutos para desnaturalizar la proteína antes de la electroforesis. Una vez finalizada la carrera, transfiera el gel a las membranas de PVDF. Para bloquear la membrana, incubela en leche descremada al 5% durante dos horas a temperatura ambiente.
A continuación, incubar la membrana con los anticuerpos primarios correspondientes durante 24 horas mientras se utiliza el anticuerpo beta-actina como control interno. Posteriormente, incubar las membranas con el correspondiente anticuerpo secundario IgG anti-conejo de cabra a temperatura ambiente durante dos horas. Finalmente, trate las membranas con una cantidad adecuada de solución de trabajo de quimioluminiscencia mejorada para la detección de bandas de proteínas.
Los resultados cuantitativos de la RT-PCR mostraron que la expresión relativa del ARNm de C1GalT1 y Cosmc se reguló a la baja en las células DAKIKI del grupo modelo, en comparación con el grupo de control. La dioscina aumentó el ARNm relativo de ambos dos grados diferentes en comparación con el grupo modelo. Los resultados de la Western blot también mostraron que, en comparación con el grupo de control, la expresión de proteínas de C1GalT1 y Cosmc en las células DAKIKI del grupo modelo disminuyó.
Las expresiones de proteínas se regularon al alza después de la intervención con dioscina.
