Para comenzar, recoja las PBMC tratadas con fármacos por centrifugación y recoja el lisado celular en una placa de PCR. Centrifugar la placa para recoger el lisado en la parte inferior. A continuación, realice la desnaturalización del ARNm con un termociclador.
A continuación, añada seis microlitros de la mezcla de reacción de transcriptasa inversa a cada pocillo para conseguir un volumen total de 12 microlitros. Selle la placa para protegerla contra la contaminación y evitar la evaporación. Centrifuga la placa después de vórticela brevemente.
Coloque la placa en el termociclador e inicie el programa de reacción de transcripción inversa. Después de la transcripción inversa, centrifugar la placa de PCR, agregar 15 microlitros de la mezcla de preamplificación en cada pocillo y sellarla. Coloque la placa sellada en el termociclador e inicie la reacción de preamplificación.
Para limpiar el ADNc, agregue perlas de purificación magnética a cada pocillo e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Coloque la placa de PCR en una rejilla magnética durante cinco minutos o hasta que las perlas se separen. Después de eso, retire con cuidado el sobrenadante.
Mientras mantiene la placa en la rejilla magnética, introduzca suavemente 100 microlitros de etanol al 80% recién preparado para limpiar las perlas. Después de una incubación de 30 segundos, use una pipeta para eliminar el sobrenadante. Deje que las perlas se sequen al aire en la rejilla magnética durante cinco minutos o hasta que el etanol se evapore por completo y las perlas ya no parezcan brillantes.
Después de retirar la placa de la rejilla magnética, vuelva a suspender las perlas en 20 microlitros de agua libre de nucleasa. Vuelva a colocar la placa en la rejilla magnética hasta que las cuentas estén separadas. Transfiera el eluit a una placa de PCR nueva preparada para el control de calidad y el etiquetado del ADNc.
Para el etiquetado, agregue tres microlitros de la mezcla de etiquetado para cada reacción en una nueva placa de PCR. Agregue un microlitro de ADNc a cada reacción. Inicie la reacción de etiquetado inmediatamente.
A continuación, neutralice la reacción añadiendo un microlitro de tampón de etiquetado neutralizado a cada reacción. Para la PCR de enriquecimiento, agregue nueve microlitros de la mezcla de PCR de enriquecimiento en cada reacción para lograr un volumen total de 14 microlitros. Inicie el programa de PCR de enriquecimiento.
