Whole Mount Preparation and Confocal Imaging of the Murine Ocular Lens Anterior Region for Structural, Developmental, and Functional Insights

Comience el procedimiento creando hendiduras de inmovilización en agarosa. Para ello, calentar y mezclar agarosa al 2% en PBS, utilizando un microondas, hasta que la solución esté licuada. Pipetear 250 microlitros de agarosa licuada en un plato con fondo de vidrio.

Y, con una tapa de plástico flexible, aplana la agarosa a lo largo del plato. Una vez que la agarosa se enfríe y se solidifique por completo, use pinzas de punta fina para quitar el cubreobjetos. Luego, con un punzón de biopsia de tres milímetros, crea un agujero en la agarosa en el centro del plato.

Con la ayuda de una toallita delicada, retira el exceso de agarosa. Guarde el molde de agarosa, hidratado con PBS, a cuatro grados centígrados, hasta su uso. Antes de montar la lente ocular de espejo aislada, agregue dos mililitros del medio apropiado al molde de agarosa preparado, según el tipo de lente.

Con unas pinzas embrionarias, transfiera suavemente el cristalino fijo o vivo a la hendidura de la agarosa. Luego, coloque el plato en una platina de microscopio invertida. Confirme que el cristalino está situado con la región anterior orientada hacia el objetivo, visualizando la tinción de los núcleos.

Si no se observan núcleos, utilice pinzas curvas para girar suavemente el cristalino aproximadamente 180 grados, de modo que la región anterior mire hacia el objetivo. A continuación, proceda a adquirir imágenes utilizando un microscopio confocal. Para la visualización de cápsulas de lentes, adquiera imágenes de pila Z utilizando un objetivo de 40x, con un tamaño de paso de 0,3 micras.

Adquiera la primera imagen antes de la superficie de la cápsula del cristalino, indicada por la tinción WGA, y la última imagen después de la superficie apical de las células epiteliales. Para visualizar las células epiteliales, adquiera imágenes de pila Z utilizando un objetivo de 63x con un tamaño de paso de 0,3 micras.