Para comenzar el aislamiento de células individuales de las biopsias gástricas recogidas durante la endoscopia superior del paciente, primero hay que dejar que el tejido se asiente en el fondo de un tubo cónico de 15 mililitros. Una vez asentado, utilice una pipeta para aspirar el medio y lave las biopsias dos veces con un mililitro de PBS suplementado con antibióticos. Transfiera un mínimo de 20 miligramos del tejido a un tubo de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de PBS suplementado con TDT.
Use tijeras de disección finas para cortar el tejido en pedazos de uno a dos milímetros o menos. Utilice una minicentrífuga de mesa durante 15 segundos para agregar las piezas de tejido en la parte inferior del tubo, luego aspire la mayor cantidad de sobrenadante posible. Agregue cinco mililitros de tampón de digestión recién calentado a un tubo cónico de 50 mililitros.
Transfiera 500 microlitros del tampón de este tubo al tubo de 1,5 mililitros que contiene las piezas de tejido. A continuación, con unas tijeras, corte a 1.000 microlitros la punta de la pipeta desde la parte inferior para aumentar el diámetro de la punta y minimizar la pérdida de tejido. Ahora, con la punta de pipeta modificada, transfiera los pequeños trozos de tejido del tubo de 1,5 mililitros al tampón de digestión en el tubo de 50 mililitros.
Incubar el tampón de digestión y la mezcla de tejidos a 37 grados durante 30 minutos con agitación orbital a 200 RPM. A continuación, añadir cinco mililitros de tripsina calentada con EDTA al 0,25% al tejido en el tampón de digestión e incubar. Neutralice el tampón de digestión y la tripsina agregando un volumen igual de medio DMEM/F-12 avanzado y pase la suspensión a través de un filtro celular de 70 micras.
