Una vez que los organoides gástricos derivados del paciente estén listos para su envasado, comience la eliminación rutinaria de los organoides. Primero, retire el medio de cada pocillo, que contiene los organoides, incrustados en la matriz de la membrana basal, hechos en la placa de 24 pocillos. A continuación, dispense un mililitro de medios DMEM F12 avanzados helados, directamente sobre una cúpula de matriz de membrana basal.
Continúe aspirando y dispensando el medio, hasta que todos los fragmentos de la cúpula se desprendan de la placa. A continuación, transporte tanto el medio como la matriz de membrana basal fragmentada del pocillo al siguiente pocillo y repita el proceso para todos los pocillos programados para el envasado. Después de desmontar la última cúpula de matriz de membrana basal, dispense el medio y la mezcla en un tubo de 1,5 mililitros.
Coloque una punta de 1000 microlitros en una pipeta P1000 y, a continuación, inserte esta punta en una punta de 200 microlitros. Con esta configuración de pipeta, pipetee vigorosamente la mezcla de la matriz de organoides hacia arriba y hacia abajo, aproximadamente 25 veces para fragmentar los organoides en trozos pequeños. Centrifugar la mezcla de organoides fragmentados, utilizando una centrífuga de mesa a cuatro grados centígrados durante 30 segundos a 2000 G. Con una pipeta, aspire el medio y el sobrenadante de la matriz de la membrana basal.
Agregue el volumen calculado de matriz fresca de membrana basal a los organoides granulados en el tubo. Pipetear suavemente el contenido del tubo hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Rápidamente alícuota, 50 microlitros de la mezcla de la matriz organoide en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos.
Cubra el plato inmediatamente y con un solo movimiento suave, voltee el plato boca abajo. Coloque la placa invertida en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius durante 35 minutos para permitir que la matriz de la membrana basal se polimerice. Finalmente, agregue 500 microlitros de medio organoide gástrico precalentado a cada pocillo.
Para el día 20 después de la iniciación, los organoides estaban listos para ser pasados, indicados por un gran tamaño de organoide o un interior oscurecido. Los organoides que se dejaron ir más allá de estos puntos, comenzaron a descomponerse en monocapas 2D. Después de empaquetar y volver a sembrar gástricamente, las cúpulas contenían muchos fragmentos de organoides que se reorganizaron en muchos más organoides muy rápidamente.
