Lave las células tratadas anteriormente con PBS helado para eliminar cualquier medio residual y agregue 50 microlitros del tampón de lisis RIPA que contiene PMSF para lisar las células. Recoja las células en un tubo. Incubar las células en hielo durante unos minutos para asegurar una lisis completa, luego centrifugar a cuatro grados centígrados a 12.000 g durante 15 minutos.
A continuación, mezcle el lisado celular con un tampón de carga y caliente la mezcla a 95 a 100 grados centígrados durante cinco a 10 minutos al baño maría para desnaturalizar las proteínas. Cargue 10 microlitros de proteína total de cada muestra en un gel SDS0-PAGE. Ejecute el gel bajo un voltaje constante de 80 voltios.
Detenga la electroforesis cuando el azul de bromofenol llegue al fondo del gel de separación. A continuación, utilice un sistema de transferencia húmeda en un baño de hielo para transferir las proteínas separadas del gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Después de completar la transferencia, retire la membrana e incube la membrana en un tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora.
Incubar la membrana con un anticuerpo secundario conjugado con HRP. Visualice las bandas de proteínas en la membrana utilizando un sustrato quimioluminiscente y capture la señal utilizando un sistema de imágenes de quimioluminiscencia. El análisis de Western blot mostró que la expresión suprimida de FAM83A aumentó las proteínas Bax y caspasa-3 escindida, disminuyó la expresión de BCL-2 y aumentó la liberación de citocromo c.
