Para comenzar, coloque cubreobjetos estériles en los pocillos de las placas de cultivo de tejidos de seis pocillos y vierta un volumen adecuado de poli-L-lisina y solución laminada en los pocillos para cubrir el cubreobjetos. A continuación, selle la placa con una envoltura de plástico para reducir la evaporación e incube a cuatro grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, lave los cubreobjetos tres veces con PBS estéril.
Agregue dos mililitros de suspensión celular y medio de crecimiento a la placa de 10.000 células a cada pocillo que contenga el cubreobjetos. Después de lavar los cubreobjetos con PBS, fije las celdas con una solución de paraformaldehído al 4% y PBS durante 18 minutos. Enjuague los cubreobjetos tres veces con PBS durante cinco minutos antes de la inmunotinción.
Incubar los cubreobjetos inmunoteñidos y lavados en uno a cinco microgramos de tinte Hoechst durante 10 minutos. A continuación, lave los cubreobjetos con PBS durante cinco minutos más. Monte los portaobjetos utilizando una proporción igual de mezcla de PBS y glicerol y capture las imágenes con un microscopio fluorescente.
Trate las células con una solución de disociación celular no enzimática durante 30 segundos a un minuto. A continuación, añada cinco mililitros de DMEM por cada mililitro del reactivo de disociación celular no enzimática. Cuente las células con un hemocitómetro.
Centrifuga las células a 5G durante cinco minutos. Resuspender las células a una concentración de una o dos veces 10 de las sextas células por cada 100 microlitros de DMEM. Coloque al animal boca abajo y esterilice el lugar de la inyección con etanol al 70%.
Inyecte una o dos veces 10 de las sextas células por vía subcutánea en el flanco derecho. Coloque al ratón solo en una jaula libre de ropa de cama y deje que se recupere. Para prevenir la hipotermia, coloque una parte de la jaula sobre la almohadilla térmica.
Se muestran imágenes de baja y alta potencia de las células MPNST P0 GGF beta 3 de paso temprano. Se encontró que las células eran tumorogénicas, formando colonias en agar blando e injertos en ratones inmunodeficientes.
