Para comenzar, tome las secciones de cerebro de parafina de seis ratones negros C57 inyectados con PFF. Desparafina los portaobjetos sumergiéndolos en sustituto de xileno e incubándolos durante dos minutos. Para la rehidratación, sumerja los portaobjetos en etanol al 100% 95% y 70%, y luego dos veces en agua desionizada.
Transfiera las muestras a un recipiente apto para microondas junto con agua destilada doble. Calentar el tampón de citrato 100 veces con pH seis a cuatro grados centígrados. Luego prepare 350 mililitros de tampón de citrato fresco.
Vierta el tampón de citrato preparado en un recipiente de plástico con tapa. Coloque los portaobjetos en el recipiente de tampón de citrato y asegure la tapa. Calienta las muestras en el microondas a 700 vatios durante cuatro minutos y luego deja tiempo para un descanso de cinco minutos.
Cocine en el microondas durante otros 1,5 minutos, seguido de un período de descanso de cinco minutos y reponga el tampón de citrato. Cocine en el microondas durante 1,5 minutos y déjelo reposar durante cinco minutos. A continuación, enfríe las muestras y el tampón de citrato en hielo durante 20 minutos y lávelos con agua bidestilada.
Seque los portaobjetos de muestra con una toalla de papel sin tocar el tejido. Con un bolígrafo de papanicolaou, dibuja rectángulos alrededor de los pedazos de pañuelo. Ahora transfiera todos los portaobjetos a una caja de tinción inmune a portaobjetos.
Lávelos suavemente varias veces con TBS-T asegurándose de que las gotas de TBS-T permanezcan dentro de los rectángulos de la pluma PAP. Golpee las diapositivas sobre una toalla de papel para quitar TBS-T. Agregue 50 microlitros de bloqueo a cada rectángulo e incube durante una hora a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, con una toalla de papel, retire la solución de bloqueo de las muestras. Pipetear suavemente 50 microlitros de la mezcla primaria de anticuerpos y TBS-T en cada rectángulo e incubar las muestras durante la noche a cuatro grados centígrados. A continuación, lave los portaobjetos con TBS-T.
Retire el TBS-T golpeando una toalla de papel. Repite este proceso tres veces. A continuación, agregue 50 microlitros de mezcla de anticuerpos secundarios a una dilución de uno a 1000 en TBS-T a cada rectángulo e incube a 37 grados centígrados durante una hora en la oscuridad.
Después, lave la muestra tres veces con TBS-T. A continuación, incubar la muestra con DAPI a una concentración de dos microgramos por mililitro en TBS-T durante un minuto. Retire la solución DAPI golpeando una toalla de papel y lave tres veces con TBS-T.
Para montar un cubreobjetos de vidrio, agregue dos gotas por portaobjetos de reactivo de montaje a las muestras. Presione suavemente el cubreobjetos para eliminar las burbujas y deje que las muestras se sequen durante una hora a temperatura ambiente. Obtener imágenes de al menos 50 células en varios campos utilizando un sistema de imágenes de fluorescencia de iluminación estructurada equipado con un objetivo de aceite 60 veces o tecnología confocal.
Para analizar las celdas, aísle la región de interés dibujando un contorno alrededor de la celda positiva o negativa y utilizando la función de recorte. A continuación, active los descriptores de forma y limite las opciones de umbral en la función de medición establecida. Ajuste el nivel de umbral seleccionando la función de umbral en el menú de ajuste.
Por último, utilice la herramienta de análisis de partículas y establezca un tamaño adecuado para capturar las mitocondrias. Por ejemplo, establezca el tamaño en 25 infinitos, luego active las unidades de píxeles y seleccione mostrar máscaras"Se muestra una cantidad sustancial de nigra pars compacta de ratones inyectados con PFF teñidos con co-amino para tirosina hidroxilasa VDAC1, PS129 alfa-sinucleína y DAPI. La tinción con alfa-sinucleína anti PS129 permitió discriminar las células que albergaban lesiones de PS129 de las células sanas.
El análisis de imágenes de la tinción con VDAC1 de neuronas positivas para tirosina hidroxilasa reveló una reducción tanto del número mitocondrial como de la relación de aspecto entre las neuronas portadoras de lesiones PS129 y las neuronas que carecían de ellas.
