Para comenzar, coloque las semillas de Arabidopsis thaliana Col-0 esterilizadas en la superficie en un plato que contenga el medio de germinación de semillas. Después de dos días de estratificación en frío, traslade la placa a una sala de cultivo a 21 grados centígrados con un fotoperiodo de día largo y un 50% de humedad. Transfiera las plántulas de una semana a una caja de cultivo de plantas con un medio de crecimiento de plantas.
Cultive el cultivo de Agrobacterium tumefaciens en medio LB hasta que alcance una densidad óptica a 600 nanómetros de 0.9 a 1. Usando una aguja montada en una jeringa de insulina, inyecte aproximadamente 50 microlitros de cultivo bacteriano en la base del tallo inflorescente primario de una plántula de Arabidopsis de un mes de edad. Raspe el tejido en la superficie del tallo primario con la jeringa.
Después de dos a cuatro semanas, extirpe las raíces pilosas emergentes y cultívelas en una placa de Petri con el medio de crecimiento de raíces pilosas complementado con antibióticos para suprimir el crecimiento agrobacteriano. Cultive la raíz pilosa a 24 grados centígrados en la oscuridad. Después de una o dos semanas, individualice las raíces pilosas en la placa con un medio de crecimiento de raíces pilosas y transfiera las líneas de raíces pilosas seleccionadas a un medio fresco cada cuatro o cinco semanas.
Transfiera las raíces pilosas a una placa con un medio de regeneración para inducir la formación de callos y cultive a 21 grados centígrados en un fotoperíodo de día largo. Una vez que los brotes emerjan del callo, córtelos y transfiéralos a un medio de elongación de brotes durante dos o tres semanas para promover el crecimiento y la elongación. Luego transfiera los brotes alargados al medio de inducción de la raíz.
Finalmente, transfiera la planta enraizada al suelo para realizar la selección transgénica. En A. thaliana, se indujeron callos amarillos en un plazo de 14 días en todas las líneas de raíces pilosas analizadas. Los primeros primordios del brote, visibles como manchas de color verde oscuro, emergieron dentro de las tres semanas posteriores a la transferencia al medio de regeneración.
Después de cuatro semanas, los brotes cubrieron las raíces pilosas en el 90% de las líneas, y algunos casos mostraron formación de raíces adventicias. Sin embargo, una línea no se regeneró ni siquiera después de tres meses. En comparación con el tipo silvestre, los regeneradores de raíces peludas de A. thaliana mostraron un fenotipo enano con sistemas radiculares densos, hojas arrugadas y tiempo de floración alterado.
