Creación del mapa de navegación para CLEM y preparación de las secciones ultrafinas para microscopía electrónica

Para comenzar, tome una sección ultradelgada de tejido cerebral de ratón que exprese mScarlet. Agregue 10 microlitros de tampón de montaje en la sección ultradelgada del vidrio de la cubierta y coloque un nuevo vidrio de cubierta limpio en el tampón de montaje. Coloque los dos cubreobjetos con la sección ultrafina en una cámara de imágenes.

Localice la sección utilizando el marcador anular en el modo de adquisición de imágenes de campo claro de un microscopio de fluorescencia invertida y muévase a una esquina de la sección. Encienda la luz blanca y capture la imagen de campo brillante. A continuación, apague la luz blanca.

Activa el láser y captura imágenes fluorescentes del mismo campo de visión. Desactive el láser y desplácese al campo de visión adyacente con un 10% de superposición. Capture tanto el campo claro como la imagen fluorescente del segundo campo de visión y registre la ruta de la imagen para unir el campo de visión.

Ahora use el mapa de navegación para apuntar a las celdas de interés. Activa el láser y captura 300 fotogramas de imágenes fluorescentes de la célula de interés. A continuación, desactive el láser.

Después, activa la luz blanca y toma aproximadamente 100 imágenes secuenciales de campo claro. Para preparar las secciones para microscopía electrónica, llene un frasco de vidrio con agua bidestilada. Retire los cubreobjetos que sujetan las secciones ultrafinas de la cámara de imágenes y sepárelos con unas pinzas.

Sujete la cubierta de vidrio con la sección. Lave el tampón de montaje con agua destilada doble y déjelo secar. Con una cuchilla de un solo lado, marque un hash alrededor de la sección ultrafina.

Deja caer 10 microlitros de ácido fluorhídrico al 12% en cada esquina de la partitura. Coloque lentamente la cubierta de vidrio en el agua. A continuación, haga flotar la película Pioloform y la sección ultrafina sobre la superficie del agua.

Coloque una cuadrícula de ranura sin recubrimiento en la sección para capturarla en el centro de la cuadrícula. Cubre un portaobjetos de vidrio con paraform. Recoja la rejilla con la película Pioloform y déjela secar al aire a temperatura ambiente.