Para comenzar, descongele y cultive células madre embrionarias H9 en un medio de mantenimiento que contenga Y-27632. En el día cero, una vez que las colonias se vuelvan 70% confluentes, lávelas con 2 mililitros de DPBS, luego incube las células con 0,5 mililitros de solución de disociación celular que contenga 20 micromoles por litro Y-27632. Para abortar la digestión, agregue 3 mililitros de medio de mantenimiento que contenga 20 micromoles por litro Y-27632.
Para granular las células, centrifugar el tubo a 190 G durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Resuspenda el pellet en un mililitro de medio químicamente definido libre de factor de crecimiento con Y-27632. Después de contar las células, agregue 1,2 millones de células a 10 mililitros de medio químicamente definido libre de factor de crecimiento y mezcle bien.
A continuación, dispense 100 microlitros de suspensión celular a cada pocillo de una placa inferior cónica de 96 pocillos. Incubar en una atmósfera humidificada al 5% de dióxido de carbono. Para inducir la formación de retina en el sexto día, agregue un medio que contenga BMP4 a cada pocillo de una placa inferior en V de 96 pocillos e incube nuevamente.
En los días nueve, 12 y 15, reemplace la mitad del medio gastado con medio nuevo sin BMP4. El día 18, transfiera cuidadosamente los cuerpos embrioides formados a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Después de la precipitación natural de los cuerpos embrioides, retire suavemente el sobrenadante y enjuáguelos con el medio de diferenciación de la retina neural.
A continuación, coloque los cuerpos embrioides en una placa de seis pocillos de baja absorción e incube la placa de nuevo. El día 21, las imágenes de campo claro mostraron una estructura neuroepitelial continua en la retina neural generada mediante este método. La tasa de éxito de la inducción retiniana fue significativamente mayor y los organoides retinianos generados mediante este protocolo fueron similares en tamaño y morfología en comparación con otros métodos.
