Para comenzar el relé G/I, prepare una mezcla de 20 microlitros en hielo con ARN total, mezcla de tampón de cola y mezcla de enzimas de cola. Incubar a 37 grados centígrados durante 60 minutos en un termociclador. Luego, agregue la solución de tope de cola y manténgala en hielo durante dos minutos.
Realizar transcripción inversa y amplificación por PCR. Después de la electroforesis en gel de alta resolución de los productos de PCR, acceda a los datos utilizando el software. Abra el archivo XAD y seleccione los nombres de ejemplo o la escalera en el panel Vista de árbol.
Acérquese y aléjese de los electroferogramas y las imágenes en forma de gel para una visualización detallada. Para obtener los tamaños de pico, abra el electroferograma de una muestra seleccionada. Haga clic con el botón derecho en el electroferograma y seleccione integración manual para seleccionar manualmente los picos arrastrando la línea horizontal.
Observe los valores máximos de la tabla de picos e identifique el pico con la mayor altura de pico. Habilite el icono Mostrar/Ocultar puntos de ajuste en el menú superior. Aparecerá un nuevo panel en el lado derecho.
Seleccione Avanzado, desplácese hacia abajo hasta Realizar análisis de frotis y seleccione la casilla de verificación. Esto agregará la tabla Región a la pestaña Electroferograma. A continuación, seleccione un electroferograma y vaya a la tabla Región.
En el menú From Base Pair y To Base Pair, establezca el par de bases inicial y final haciendo clic con el botón derecho en el electroferograma y seleccionando una región para agregar. Haga clic con el botón derecho en cualquier celda de la tabla Región y seleccione Modificar regiones para crear una pequeña ventana emergente nueva para establecer regiones personalizadas. Utilice esta ecuación para calcular la longitud de la cola de poli(A) en el ARNm de interés.
A continuación, en la pestaña Electroferograma, active Mostrar tamaños para convertir automáticamente la tabla de regiones de par base a tiempo de ejecución. Abra el archivo CSV y seleccione los valores obtenidos para el tiempo de ejecución para generar un gráfico. Utilizando este protocolo, se analizaron las longitudes de la poli(A)cola de los genes Dscam1 y GAPDH de cerebros de larvas de Drosophila, mientras que los productos de PCR de pares de cebadores específicos de genes mostraron una sola banda.
Los productos de PCR de los pares de cebadores universales específicos del gen mostraron patrones de frotis distintos, lo que indica una poli(A)longitud diferencial de los ARNm. Las longitudes medias de la cola de poli(A) se obtuvieron mediante el análisis de frotis. Y el rango de las longitudes de la cola estaba representado por electroferogramas.
De manera similar, el análisis de la longitud de la cola de poli(A) en células S2 mostró longitudes diferenciales de la cola de poli(A) para los genes SV43 prime UTR y GAPDH.
