Después de la transfección de las mPSC, aspire el medio de la placa de seis pocillos. Luego agregue 200 microlitros de tripsina en cada pocillo. Agitar e incubar durante 30 segundos a 37 grados centígrados.
Golpee el costado del plato y agregue 200 microlitros de tampón FACS helado. Con una pipeta P200, mezcle el contenido de cada pocillo para desalojar las células y hacer soluciones unicelulares. Transfiera 200 microlitros de cada pocillo al pocillo apropiado en la placa de 96 pocillos Centrifugue la placa a 300 G durante cinco minutos.
Después de la centrifugación, vuelva a suspender los gránulos en 150 microlitros de tampón FACS antes de ejecutar la muestra en un citómetro de flujo. En comparación con las transfecciones inversas, las transecciones directas mostraron una proporción significativamente menor de células positivas para el marcador. Curiosamente, el transfecto directo no entregó una cantidad significativamente menor de ADN en promedio a la población de células.
En las transecciones inversas, el tiempo de incubación influyó significativamente en el porcentaje de células reporteras positivas. Sin embargo, la expresión promedio del reportero en las células positivas no se vio afectada por el tiempo de incubación. Tanto para la poli como para la co-transfección, una transfección directa disminuyó significativamente el número de células presentes en el punto final elegido en comparación con las transfecciones inversas.
En el caso de las politransecciones inversas, se observó una mayor eficiencia de transfección y un rango dinámico más amplio de proporciones de ADN bien representadas.
