1 Para comenzar, realiceuna toma de imágenes de células vivas 2 de una sola molécula de condensados de proteínas HaloTag. 3 Con ImageJ, convierta cada canal 4 del archivo de datos de imagen sin procesar 5 en un archivo TIFF independiente. 6 Si es necesario, ejecute el peine de seguimiento previo.
Envíe un mensaje de texto 7 y siga las indicaciones 8 para reemplazar los fotogramas por los más recientes. 9 Para cargar la molécula única del archivo de película en SlimFast, 10 haga clic en cargar, seguido de la pila de imágenes. 11 Establezca los parámetros para la localización 12 y la adquisición en las hojas de opciones respectivas.
13 Visualiza las localizaciones de todas las moléculas. 14 Y usando lock all, 15 genera un archivo que contiene las localizaciones 16 de todas las moléculas en cada fotograma. 17 A continuación, vaya a cargar datos de partículas 18 y seleccione SlimFast para cargar el archivo 19 con los ajustes de localización y adquisición.
20 Utilizando la opción y el seguimiento de hojas, 21 ajuste los parámetros para la generación de trayectorias. 22 Haga clic en gen traj para generar un archivo 23 que contiene las trayectorias de todas las moléculas. 24 Cargue el archivo de seguimiento de hoja en la evaluación SPT 25 y configure los parámetros 26 para filtrar las trayectorias inferiores a 2,5 segundos.
27 Utilizando los datos de exportación, genere un archivo 28 con todas las trayectorias filtradas. 29 Ejecución de la macro ImageJ, el núcleo, 30 y la máscara de clúster versión dos. texto, 31 umbral todos los fotogramas de la película adquiridos 32 en el canal JFX549 para generar una película de lapso de tiempo 33 poblada con la máscara binaria de evolución del tiempo 34 resaltando las ubicaciones de condensado.
35 Uso de CSS de seguimiento lento de conversión ASCII 3. M, 36 reformatea las trayectorias 37 y ejecuta la categorización versión 4. M 38 para clasificarlos en función de la vida útil 39 que una molécula pasa en un condensado.
40 A continuación, usando plot residence hist CSS. M, 41 extraen la tasa de disociación observada 42 de las moléculas específicamente unidas 43 y la tasa de fotoblanqueo de la proteína en condensado 44 de interés y las trayectorias H2B. 45 Por último, calcule el tiempo medio de residencia corregido 46 de la proteína de interés, 47 específicamente unida a sus condensados.
48 Un fotograma de la película 49 de una sola molécula de dos colores de TAF15 IDR-Halo-FTH1 muestra señales 50 del núcleo en los canales PA-JF646 y JFX549. 51 Al ensamblar y clasificar, 52 se observó una clara distinción para las trayectorias 53 de las moléculas detectadas por PA-JF646 unidas a los condensados. 54 Los tiempos medios de residencia calculados 55 después de la corrección para el fotoblanqueo 56 fueron mayores para TAF15-Halo-FTH1 que para Halo-TAF15.
