Para empezar, resuspender el péptido sintetizado que actúa como control positivo a una concentración de 0,1 miligramos por mililitro en DMSO. Mezcle el péptido resuspendido con el péptido de histona H4 biotinilado para crear una curva estándar. A continuación, ensamble las reacciones de acetilación por duplicado en placas de PCR de 96 pocillos.
Una reacción de 20 microlitros debe comprender 10 microlitros de la enzima, un microlitro de péptido H4, un microlitro de tampón 20X y un microlitro de DTT. Agregue un microlitro de DMSO o el compuesto de prueba en cada pocillo. Pipetear suavemente la mezcla para mezclar.
Luego incube la mezcla en hielo durante 10 minutos para permitir la formación de complejos de inhibidores enzimáticos. Para continuar la reacción de acetilación, combine dos microlitros de coenzima A de aceite 4-Penten con cuatro microlitros de agua. Agregue seis microlitros de esta mezcla a los pocillos.
Después de mezclar suavemente, centrifugue la mezcla a 300 g durante 30 segundos a temperatura ambiente. Incubar el contenido a 37 grados centígrados durante una hora en tubos tapados. Enfríe el contenido con 20 microlitros de urea de ocho molares y guárdelo a menos 20 grados centígrados hasta su posterior procesamiento.
A continuación, pipetee 80 microlitros de PBST en cada pocillo de placas de 96 pocillos recubiertas de neutravidina negras prebloqueadas por BSA. Agregue 40 microlitros del contenido de la reacción en los pocillos de la placa. A continuación, pipetee los péptidos de curva estándar por duplicado en los pocillos restantes.
Agite suavemente los péptidos en un agitador orbital durante una hora a temperatura ambiente para facilitar la unión. Una vez que se complete la unión, aspire el líquido de los pocillos. Use una lavadora de placas para lavar los pocillos con 200 microlitros de PBST.
Para la reacción de clic, agregue la mezcla de cobre THPTA al ascorbato de sodio en agua y a la azida de biotina en DMSO. Dispense 19 microlitros de los reactivos recién mezclados en cada pocillo. Selle la placa con papel de aluminio.
Luego incubarlo a 37 grados centígrados durante una hora. Aspire la solución de los pocillos antes de lavar como antes. A continuación, agregue 100 microlitros de mezcla diluida de estreptavidina de peroxidasa de rábano picante en cada pocillo.
Incubar a temperatura ambiente durante una hora con una suave agitación en un agitador orbital. Para combinar los reactivos de detección Amplex Red, pipetee 500 microlitros de peróxido de hidrógeno diluido con el reactivo Amplex Red. Añade 50 microlitros de esta mezcla a 4,5 mililitros de fosfato de sodio.
Pipetear 100 microlitros de la mezcla de reacción Amplex Red a los pocillos lavados. A continuación, incuba la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos lejos de la luz. Inicie el software SmartControl y haga clic en Plate Out.
Una vez que la placa se haya transferido al instrumento, haga clic en el icono Amplex Red y cambie el diseño de la placa. Presione el ícono Amplex Red nuevamente para ver el diseño cambiado. A continuación, seleccione los pozos estándar de la parte superior izquierda del diseño.
Cambie el nombre del archivo y, a continuación, pulse "Iniciar ajuste". Una vez que se haya establecido la ganancia, haga clic en Iniciar medición. Presione Estado actual para observar la medición en tiempo real.
Una vez concluida la medición, cierre la pestaña. A continuación, haga clic en Abrir última ejecución en el panel superior. Vaya a la pestaña Marte.
A continuación, pulse Exportar a Excel en el menú de inicio para exportar los resultados de los datos. Se observó que los compuestos A y C inhibían la actividad de HAT1 en casi un 100% durante varias diluciones.
