Para comenzar el recubrimiento de antígenos, diluya la ovoalbúmina a cinco microgramos por mililitro con un tampón de recubrimiento. Cubra una placa ELISA de 96 pocillos con 100 microlitros de solución de ovoalbúmina por pocillo durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, lave los pozos cinco veces con PBST.
Bloquee los pozos con 250 microlitros de PBST al 1%BSA a 37 grados centígrados durante dos horas. Para preparar una dilución de suero de 1000 X, primero diluya 20 microlitros de suero a un mililitro usando 0.5%BSA PBST. A continuación, retire 25 microlitros de alícuota sérica y dilúyala a 500 microlitros utilizando PBST al 0,5%BSA.
Agregue 200 microlitros de suero diluido a 1000 X en la primera fila de la placa recubierta. A continuación, añada 100 microlitros de PBST al 0,5 % BSA a todos los pocillos, excepto a los pocillos de la primera fila. Transfiera 100 microlitros de la primera fila a la segunda fila y mezcle 10 veces.
Para crear concentraciones variables de suero para la detección de IgG, deseche 100 microlitros de líquido de la última fila. A continuación, diluya el lavado vaginal de ratones, el lavado alveolar de bronquios, los líquidos de lavado nasal con 0,5% de BSA PBST y el líquido de lavado del intestino delgado con 20% de PBST de suero de ternera fetal. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante una hora.
Lave los pocillos cinco veces con PBST. Añadir 100 microlitros de anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado HRP a los pocillos apropiados e incubar a 37 grados centígrados durante 40 minutos. Después de lavar los pocillos cinco veces con PBST, añadir 100 microlitros de sustrato ELISA de TMB e incubar en una zona protegida durante cinco minutos.
Agregue 100 microlitros de solución de parada de 450 nanómetros para terminar la reacción. Mida la absorbancia a 450 nanómetros en un lector de microplacas. Calcular el título de anticuerpos definiendo un valor de respuesta positiva como 2,1 veces el valor sérico del grupo de ratones de control.
La vacuna adyuvante en nanoemulsión aumentó significativamente los títulos de anticuerpos IgG, IgG1 e IgG2a específicos de ovoalbúmina en suero. Los niveles de IgA específica en el líquido de lavado vaginal y en el líquido de lavado del intestino delgado aumentaron significativamente cuando la ovoalbúmina se adyuvó con ácido retinoico encapsulado en nanoemulsión catiónica.
