Para comenzar, tome los huesos del fémur, la tibia, la pelvis y el húmero aislados de un ratón. Use un bisturí para cortar las placas de crecimiento de los huesos largos, eliminando la epífisis. Colócalo en un plato de 10 centímetros con M199 medium más 2%FBS en hielo.
A continuación, utilice una aguja de calibre 28 y una jeringa de 10 mililitros llena de medio M199 más 2% de FBS para enjuagar la médula en un tubo de 15 mililitros con hielo. Coloque el hueso enrojecido en el plato con la epífisis. Deje el tubo de 15 mililitros en posición vertical sobre hielo hasta que la médula se asiente.
A continuación, retire el medio M199 más 2%FBS Añada cuatro mililitros del cóctel de disociación B&M al tubo de 15 mililitros e incube en un baño de agua a 37 grados centígrados. Después de la incubación, recoja el sobrenadante y filtre a través de un colador de células de 70 micrómetros en un tubo frío de 50 mililitros. Agregue dos mililitros de cóctel de disociación B&M fresco al pellet de médula ósea restante y devuélvalo al baño de agua.
Con una pipeta de un mililitro, pipetee enérgicamente los trozos de médula ósea restantes. Recoja toda la suspensión celular en el mismo tubo que antes. Agregue 20 mililitros de medio M199 con 0.5% de BSA y dos milimolares de EDTA a la suspensión celular.
Después, centrifugar las células a 500 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Resuspender el pellet en 500 microlitros de PBS con un 0,5% de BSA y anticuerpos de biotina. Incubar en un agitador orbital durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
A continuación, vórtice las perlas magnéticas a fondo. Añade 25 microlitros de las perlas al tubo y vuelve a incubar en el agitador orbital. Coloque el tubo en un imán correspondiente durante dos o tres minutos y recoja el sobrenadante en un tubo nuevo.
Rompe los huesos en pedazos más pequeños en el plato de 10 centímetros usando el extremo de la tapa plana de un tubo de 50 mililitros. Filtre el sobrenadante a través de un filtro de células de 70 micrómetros para aislar los fragmentos óseos. Corta los fragmentos de hueso en el colador de células con unas tijeras.
Coloca el filtro con los fragmentos de hueso en un tubo de 50 mililitros y abre el filtro con el bisturí. Con unas pinzas, transfiera la fracción ósea a cinco mililitros de mezcla de disociación murina B&M. Luego coloque el tubo horizontalmente en un baño de agua a 37 grados centígrados con 120 RPM agitando durante 30 minutos.
Después de la digestión, agregue 25 mililitros de medio M199 con 0.5% de BSA y dos milimolares de EDTA. Filtre el sobrenadante que contiene células estromales a través de un filtro de células de 70 micras en un tubo frío de 50 mililitros.
