Para comenzar, cultive Escherichia coli en 5 mililitros de medio Luria-Bertani, o LB, en un tubo de cultivo estéril de poliestireno o vidrio. Incubar el tubo durante la noche a 37 grados centígrados agitando a 200 RPM. Subcultivo: el cultivo cultivado durante la noche de 1 a 50 en 100 mililitros LB en un matraz cónico.
Incubar el cultivo a 37 grados centígrados y 200 RPM durante aproximadamente 1,5 horas. A continuación, agregue 100 microlitros del stock de fagos T4 de alto título en el cultivo de E. coli e incube a 37 grados Celsius agitando durante tres horas. Una vez que el lisado del fago T4 esté limpio, recójalo en un tubo cónico de 50 mililitros.
Centrifugar los lisados a 4.000 g durante 20 minutos para granular las bacterias y restos celulares restantes. Filtre el sobrenadante resultante con un filtro de nailon de 0,22 micras y recoja el filtrado en un nuevo tubo de 50 mililitros. Agregue 0,1 volumen de cloroformo al lisado de fagos T4 filtrado para matar las bacterias restantes y evitar el crecimiento bacteriano.
Agite brevemente e incube el lisado a temperatura ambiente durante diez minutos. Centrifugar el lisado a 4.000 g durante cinco minutos para separar el cloroformo del lisado. Con una pipeta serológica, transfiera con cuidado la capa superior de lisado a un nuevo tubo de 50 mililitros.
Agregue 13 mililitros de lisado de fagos al depósito superior del dispositivo de filtro centrífugo de 100 kilodalton. Concentrar el lisado en 4.000 g durante cinco minutos, o hasta que la mayor parte del lisado haya pasado por el filtro. Con una pipeta P200 o P1000, pipetee suavemente los 2 mililitros restantes de lisado hacia arriba y hacia abajo, dentro del depósito superior, para destapar la membrana del filtro.
Deseche el filtrado del depósito inferior en un contenedor de desechos. Repita la concentración y retenga aproximadamente 2 mililitros de fago concentrado en el depósito superior. Después del último centrifugado, pipetear suavemente el lisado restante hacia arriba y hacia abajo, en el depósito superior.
Para lavar el lisado de fagos, añadir 12 mililitros de tampón salino magnésico (SM) al depósito superior y centrifugar a 4.000 g durante 10 minutos. Después del segundo lavado, vuelva a suspender los 2 mililitros restantes de lisado en el tampón SM hasta un volumen final de 10 mililitros. Transfiera el lisado a un tubo de 50 mililitros y guárdelo a 4 grados centígrados.
Para eliminar las endotoxinas contaminantes, agregue 0,4 volúmenes de 1-octanol al volumen total de lisado. Selle la tapa del tubo con una película de sellado y agite a 120 RPM durante una hora, seguido de la incubación a 4 grados centígrados durante 1,5 horas sin agitar. Centrífuga para separar el lisado eliminado de endotoxinas del 1-octanol.
Retire con cuidado la mayor cantidad posible de 1-octanol, utilizando una pipeta P1000, y deséchelo en el contenedor de residuos adecuado. Con una aguja de calibre 18 y una jeringa de 10 mililitros, recoja el lisado de fagos debajo de la capa restante de 1-octanol. Transfiera 1 mililitro de alícuotas de lisado de fago T4 a tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mililitros.
Aspire a velocidad los tubos con las tapas abiertas a 4.000 g para evaporar el 1-octanol residual del lisado. Prepare una dilución en serie de lisado de fagos en factores de 10, luego coloque 5 microlitros de cada dilución en las placas de agar LB e incube las placas durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, cuente las placas para calcular las unidades formadoras de placas, o PFU.
Diluir el lisado resultante y el tampón SM a la concentración deseada y retiter para confirmar. Almacenar el lisado concentrado a 4 grados centígrados hasta su uso.
