1 Después de diseccionarscBAT 2 del ratón sacrificado, 3 coloque inmediatamente el tejido en un tubo de microcentrífuga. 4 Haz un agujero en la parte superior del tubo con una aguja estéril 5 y congela el nitrógeno líquido. 6 Remoja un mortero y una espátula delgada en nitrógeno líquido.
7 Vierta la muestra de tejido congelado 8 del tubo de microcentrífuga en el mortero. 9 Agregue una pequeña cantidad de nitrógeno líquido al mortero 10 y muela bien el tejido con el mortero 11 hasta que esté completamente pulverizado. 12 Use la espátula delgada para raspar y transferir 13 el tejido pulverizado de regreso al tubo de microcentrífuga.
14 Una vez que se transfiere todo el tejido, 15 agregue 500 microlitros de solución de aislamiento de ARN al tubo 16 y sonique durante 30 segundos usando un motor de mortero de pellets. 17 A continuación, use una jeringa para pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces 18 para piar aún más el tejido, 19 asegurándose de que no se vean partículas sólidas. 20 Agregue 250 microlitros de cloroformo y vórtice de vez en cuando 21 durante una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente.
22 Centrifugar las muestras a 21.000 g durante 20 minutos 23 a cuatro grados centígrados. 24 Transfiera la capa acuosa superior a un nuevo tubo 25 y agregue una cantidad equivalente de etanol al 70%. 26 Transfiera 500 microlitros del lisado 27 a una columna de unión.
28 Centrifugar a 18.000 g durante 60 segundos 29 y desechar el filtrado. 30 Para la transcripción inversa, agregue de 0,5 a un microgramo 31 de ARN diluido en agua tratada con DEPC a una tira de tubo de PCR. 32 A continuación, diluir el CDNA a 250 nanogramos por microlitro 33 utilizando agua tratada con DEPC y configurar la PCR cuantitativa.
34 Los niveles de expresión de los genes marcadores implicados 35 en la mediación de la función de scBAT fueron relativamente similares 36 entre scBAT y murciélago interescapular.
