Para comenzar, use un lápiz de diamante para dividir una cubierta de vidrio estándar en tres tiras iguales. Use grasa de vacío para pegar un trozo de la tira deslizante de la cubierta en la parte inferior de un soporte de cámara casero. Del mismo modo, coloque la segunda pieza de la tira deslizante de la cubierta en la parte superior del soporte de la cámara.
A continuación, utilice una pistola de pipetas para inyectar 200 microlitros de la suspensión RBC etiquetada entre los dos cubreobjetos. Para montar la configuración de aspiración de micropipetas, monte la cámara de células en la platina de soporte en una plataforma de microscopio. Ajuste la posición de la cámara hasta que esté directamente debajo del objetivo.
Ahora baje el soporte hasta que esté por debajo del nivel de líquido del depósito de agua conectado. Inyecte agua desmineralizada en la micropipeta, luego use una jeringa equipada con una aguja de calibre 34 para eliminar las burbujas de aire. Desenrosque el extremo del soporte de la micropipeta hasta la mitad y deje que el agua gotee del soporte durante unos segundos.
A continuación, inserte la micropipeta rellena de suspensión en la punta del soporte y apriete el tornillo del soporte. Coloque la micropipeta en la cámara celular. A continuación, localice la pipeta y los glóbulos rojos bajo el microscopio.
Baje la punta de la pipeta para asegurarse de que esté nivelada con el RBC localizado. Ajuste la altura del depósito de agua a cero la presión hidráulica en la punta. Luego, levante ligeramente el depósito de agua para generar una presión positiva sutil.
Encienda la fuente de luz de excitación fluorescente de 488 nanómetros. Encienda la cámara fluorescente y la cámara transmitida. Introduzca el tiempo de exposición, la región de interés y el tamaño de agrupación de ambas cámaras en el software correspondiente.
A continuación, configure el número de adquisición en 2000 en el panel Adquisición multidimensional. Elija el directorio de guardado requerido. A continuación, localice la micropipeta con la ayuda del micromanipulador.
Encienda la pinza de presión neumática y asegúrese de que la caja de control esté en modo externo. Gire lentamente la perilla para compensar cualquier presión de compensación dentro del sistema. Inicie el software que controla la pinza neumática.
Utilice el panel de control eléctrico para mantener la presión controlada con un factor de conversión de mercurio de 20 milivoltios por milímetro. Ahora ponga a cero la presión dentro del sistema, luego reubique con cuidado la micropipeta cerca de los glóbulos rojos. Ajuste la posición del depósito de agua para generar una presión positiva sutil en la punta de la micropipeta.
Inicie la adquisición en el software de la cámara y encienda el obturador de fluorescencia. Escriba la magnitud de voltaje calculada en el panel de control para alcanzar la presión deseada y aspirar un RBC. Mantenga la presión durante un período preestablecido y luego suéltela.
Del mismo modo, repita el experimento con el siguiente RBC antes de continuar el análisis. El aumento incremental de la presión dio lugar a una mayor movilización de iones de calcio en los glóbulos rojos.
