Para comenzar, prepare 10 mililitros de tampón de reacción 2X AlkB y esterilicelo a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras. En un tubo de PCR estéril, agregue 20 microlitros de los ARN ligados al enlazador 1, 50 microlitros del tampón de reacción 2X AlkB, dos microlitros de la AlkB desmetilasa, un microlitro de inhibidor de ARN y 27 microlitros de ARN de agua libre para preparar la reacción de digestión de AlkB. Incubar la mezcla de digestión AlkB a temperatura ambiente durante dos horas para eliminar la metilación postranscripcional de los ARN.
Para una separación de fase limpia, agregue 50 microlitros de agua libre de ARN en la reacción AlkB. Luego, agregue 100 microlitros de mezcla de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico. Agite el tubo durante 10 segundos.
Centrifugar la mezcla de AlkB a 16.000 g durante 10 minutos. Transfiera aproximadamente 140 microlitros de los ARN que contienen la capa acuosa superior a un tubo estéril de 1,5 mililitros. Para eliminar el fenol residual, agregue 100 microlitros de cloroformo a los ARN extraídos y agite el tubo.
Centrifugar la mezcla a 16.000 g durante 10 minutos y transferir aproximadamente 120 microlitros de la capa acuosa superior a un tubo estéril de 1,5 mililitros. Después de la reacción de transcripción inversa, agregue un microlitro de hidróxido de sodio de cinco molares en el híbrido de ADNc de ARN. Incubar a 93 grados centígrados durante tres minutos para hidrolizar la cadena de ARN del híbrido de ARNc.
A continuación, añade 0,77 microlitros de ácido clorhídrico de cinco molares para neutralizar la reacción. Prepare un gel de agarosa al 3% en tampón TAE. Mezcle un microlitro de colorante de carga 6X en cinco microlitros de producto PCR y cargue el gel con la mezcla.
Cargue cinco microlitros de 50 o 100 escalas de ADN de pares de bases en el pocillo antes de la primera muestra y en el pocillo después de la última muestra. Ejecute la electroforesis en gel a 120 voltios y 400 miliamperios durante 75 minutos para localizar los productos de PCR. Después de la electroforesis, coloque el gel en una caja y llénela con agua desionizada hasta que el gel esté completamente sumergido.
Agregue 10 microlitros de bromuro de etidio en el agua. Envuelva la caja con papel de aluminio y manche durante 30 minutos en una coctelera. Deseche el agua que contiene bromuro de etidio en una botella de desecho colocada en una campana extractora.
Enjuague el gel con agua desionizada una vez y deseche el agua en una botella de desecho. Después de lavar el gel con agua desionizada durante 10 minutos, use un generador de imágenes en gel para visualizar las bandas y adquirir una imagen de alta resolución del gel.
