Análisis de la función mitocondrial en pequeñas colonias de Candida glabrata inducidas por bromuro de etidio

Para comenzar el cultivo de Candida glabrata, coloque todos los materiales experimentales en la plataforma de trabajo. Elija una sola colonia de C. glabrata de una placa de levadura, peptona dextrosa o agar YPD. Y transfiéralo a un tubo de ensayo de vidrio que contenga 3 mililitros de medio YPD.

Incubar durante 14 a 16 horas a 25 grados centígrados con agitación a 155 RPM. Después de la incubación, diluir el cultivo en YPD fresco para obtener una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,1. Incubar el cultivo diluido a 25 grados centígrados durante seis horas agitando a 155 RPM.

Prepare una suspensión de levadura a una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,1 pulgadas YPD a 3 mililitros. Agregue 30 microlitros de caldo de bromuro de etidio e incube la suspensión de levadura durante la noche a 25 grados Celsius a 155 RPM en un ángulo de 45 grados. Al día siguiente, ajuste la densidad óptica del cultivo a 0,65 con medio YPD fresco.

En una placa de 96 pocillos, agregue 20 microlitros de la suspensión de levadura a 180 microlitros de PBS por pocillo para una dilución diez veces mayor. Coloque 20 microlitros de cada dilución en cuatro cuadrantes de la placa de agar YPD. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados.

Al día siguiente, seleccione cuadrantes con cinco a 80 colonias y agregue 20 microlitros de trifenil tetrazolio al 20%. Y agregue 20 microlitros de cloruro de trifenil tetrazolio al 20% directamente en el centro de cada colonia. Incuba la placa a 37 grados centígrados durante 30 a 40 minutos.

Escanee placas a 1200 DPI con un escáner óptico a todo color de 48 bits. El agente intercalante del ADN, el bromuro de etidio, induce eficazmente mutantes pequeños de C. glabrata.