Análisis de la función mitocondrial en terapia fotodinámica antifúngica inducida por pequeñas colonias de Candida glabrata

Para comenzar, coloque el cultivo de Candida Glabrata y el medio YPD en una plataforma de trabajo. Ajuste la densidad óptica de la suspensión de células de levadura a 600 nanómetros a 0,65 con medio YPD. Mezcle un mililitro de Suspensión de Levadura con 111 microlitros de Rosa de Bengala al 2% en un tubo redondo con tapón.

Incubar la mezcla a 25 grados centígrados durante 15 minutos, girando en un ángulo de 45 grados a 155 RPM. Después de la incubación, transfiera la mezcla a un tubo de 1,5 mililitros y centrifugue a 16, 100 G durante 2,5 minutos. Deseche el sobrenadante y raspe suavemente el tubo cinco veces para volver a suspender el pellet.

Lave la suspensión con PBS cuatro veces para eliminar toda la rosa de Bengala. Después del lavado final, transfiera 200 microlitros de la suspensión de levadura cargada con Rose Bengal a cada uno de los tres pocillos en una placa de 96 pocillos. Coloque la placa en el sistema de iluminación fotodinámica con bombillas LED que emitan luz verde desde abajo.

Active el sistema de luz LED para administrar la dosis de terapia fotodinámica de 4,38 julios por centímetro cuadrado durante dos minutos. Después de la irradiación, agregue 20 microlitros de suspensión de levadura a un pocillo que contenga 180 microlitros de PBS, creando una dilución diez veces mayor. Para cada factor de dilución, coloque 20 microlitros por cuadrante en las placas de barrena YPD.

Invierta la placa e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, cuente el número de colonias en cada cuadrante. Usando la fórmula dada, calcule las unidades de formación de colonias por mililitro.

Agregue 20 microlitros de cloruro de trifenilo tetrazolio al 20% directamente en el centro de cada colonia e incube a 37 grados centígrados durante 30 a 40 minutos. Escanee placas a 1.200 ppp con un escáner óptico a todo color de 48 bits. Después de preparar la suspensión de levadura TZero en la fase de crecimiento retrasado, exponerlos a 4,38 julios por centímetro cuadrado de luz verde en presencia de 0,2% de rosa de Bengala.

Denota los hongos supervivientes como T-1. Exponga los hongos supervivientes a la misma dosis de PDT. Los mutantes pequeños de C-Glabrata exhibieron un crecimiento más lento en comparación con los hongos parentales no tratados de tamaño regular.

Un solo tratamiento antimicrobiano de terapia fotodinámica inhibió significativamente el crecimiento de C-Glabrata en tres retrasos en comparación con el control. C-Glabrata, 24 horas después del tratamiento con terapia fotodinámica antimicrobiana, mostró una distribución del tamaño de las colonias bimodal con colonias grandes y pequeñas. Las colonias pequeñas que mantuvieron un color blanco exhibieron disfunción mitocondrial, mientras que algunas colonias más pequeñas de color rojo y colonias de tamaño normal conservaron la función mitocondrial normal.