Para empezar, obtenga el virus clarificado a partir de células cultivadas. Coloque los tubos de ultracentrífuga en una rejilla en el lado de salida de la bomba peristáltica multicanal. Con una pipeta serológica, dispense cuidadosamente 10 mililitros de virus clarificado en cada tubo de ultracentrífuga.
Luego, transfiera 22 mililitros de la fracción de yodixanol al 15% a un tubo cónico limpio de 50 mililitros. Coloque los capilares del lado derecho de la bomba en el tubo y encienda la bomba. Detenga la bomba.
Cuando la fracción de yodixanol llegue al final de los capilares en el lado de salida de la bomba, inserte un capilar de salida en cada tubo de ultracentrífuga con virus clarificado y encienda la bomba. Detenga la bomba cuando la última fracción del 15% esté a punto de entrar en los capilares de entrada. A continuación, transfiera 22 mililitros de la fracción de yodixanol al 25% al tubo cónico de 15 mililitros.
Después de encender la bomba, deje que toda la fracción se lleve a los capilares de entrada y detenga la bomba. Si es necesario, agregue más de la fracción del 60% y llene cada tubo hasta que el lisado forme una cúpula sobre la parte superior pero no se desborde. Detenga la bomba y retire con cuidado el capilar de salida.
Tape el tubo de ultracentrífuga con un espaciador y cárguelo en un rotor tipo 70 TI. Después de la centrifugación, sujete el tubo de ultracentrífuga a un soporte de soporte. Con una toallita sin pelusa, retire la tapa del tubo de ultracentrífuga.
Luego, conecte una aguja de calibre 20 a una jeringa de 5 mililitros y penetre en la pared del tubo de ultracentrífuga con la aguja aproximadamente 3 mililitros por debajo de la interfaz de 40 y 60% de yodixanol. Aspire lentamente la interfaz y parte de la fracción del 40%. Sosteniendo un dedo sobre la parte superior abierta del tubo de ultracentrífuga, saque la jeringa y transfiera la fracción AAV aspirada a un tubo cónico de 50 mililitros.
Por último, diluir la fracción de virus aspirada dos veces en tampón de lisis AAV hasta un volumen de 40 mililitros. Después de enjuagar un tubo peristáltico, cargue 20 mililitros de la fracción diluida de AAV en un nuevo tubo de ultracentrífuga para la segunda ronda de fraccionamiento.
