Para comenzar, agregue 500x de tinte naranja a una solución PBS para lograr diferentes proporciones de tinte, inicie el software de adquisición de datos en el escritorio. Haga clic en Instrumento, luego elija el modelo de microplaca correspondiente y seleccione Aceptar. Haga clic en la configuración de adquisición y elija Fluorescencia.
En la interfaz de longitud de onda, establezca la lambda uno en 470 nanómetros y 570 nanómetros y, a continuación, pulse Aceptar. Pipetee 100 microlitros de cada concentración del tinte naranja en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Coloque la placa en la etapa de detección del instrumento lector de microplacas fluorescentes.
Haga clic en el icono Leer del software y mida la fluorescencia de cada concentración de colorante 13 veces a temperatura ambiente con un intervalo de dos minutos. Después de cada determinación, haga clic en el icono Exportar y, a continuación, seleccione Exportar a XML XLS TXT. Elija todos los platos.
A continuación, seleccione Placa en el formato de salida y haga clic en Aceptar para guardar los datos en el formato XLS para su posterior análisis. Ahora, encienda el baño seco de agitación de calefacción digital. Ajuste la temperatura de calentamiento a 35 grados centígrados y el tiempo de calentamiento a dos minutos.
Prepare la proporción óptima de dilución del tinte en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Luego colóquelo en el baño seco de agitación de calentamiento digital durante dos minutos. Ahora, agregue 100 microlitros de PBS y las soluciones de tinción a los pocillos de la placa.
Coloque la placa en la etapa de detección del instrumento. Haga clic en el icono Leer en el software de adquisición de datos. Ajuste la temperatura de calentamiento a 40 grados centígrados y el tiempo de calentamiento a dos minutos.
Ahora, pipetee la solución de tinte en la placa nuevamente en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Caliéntelo en el baño seco de agitación de calentamiento digital durante dos minutos. Repita la adición de las soluciones de colorante, exportando los datos resultantes para probar la absorbancia de la solución de colorante en incrementos de temperatura de cinco grados de 35 a 95 grados Celsius.
Combine la solución de proteína CD40 con PBS para obtener concentraciones finales de 5, 10, 15 y 20 microgramos por microlitros. A continuación, combine el tinte naranja con PBS para obtener una concentración final de uno es hasta 500. Evalúe la absorbancia de la solución de proteína CD40 en incrementos de temperatura de cinco grados de 35 a 95 grados Celsius.
Guarde los datos como archivos XLS, luego calcule el punto de fusión o el valor TM utilizando el software de análisis de datos. A continuación, mezcle CD40 y umbeliferona en la solución de PBS. A continuación, pipetee el tinte naranja en el PBS para obtener una concentración de solución de uno es hasta 500.
Mida la absorbancia de la solución de complejos de umbelífera CD40 en incrementos de temperatura de cinco grados de 35 a 95 grados Celsius. El tinte naranja exhibió consistentemente una excitación de fluorescencia estable tanto a temperatura ambiente como a temperaturas elevadas. Se determinó una relación de dilución óptima de uno es a 500.
Se detectó un valor estable de TM de 51,82 grados Celsius a una concentración de 15 microgramos por mililitro, que disminuyó a 45,79 grados Celsius con un aumento en la concentración de la proteína CD40.
