Comience por linealizar el vector. Prepare la mezcla de reacción que contenga enzimas de restricción específicas a temperatura ambiente. Use un kit de extracción en gel para purificar los vectores linealizados, luego incube a 37 grados Celsius durante 60 minutos.
A continuación, ensamble la clonación sin fisuras del exón R y la reacción de ensamblaje para subclonar el gen PRRSV. Ajuste el volumen total de reacción a 10 microlitros con agua desionizada esterilizada. Luego, mezcle bien.
Incubar la mezcla en un termociclador durante 15 a 60 minutos a 50 grados centígrados. Después, guarde las muestras en hielo. Después de transformar el vector en células competentes, elija ocho colonias en 20 microlitros de medio LB que contenga kanamicina.
Configure una reacción de PCR de colonia para analizar los transformantes. Se obtuvo un vector de sobreexpresión de PRRSV de longitud completa introduciendo el fragmento uno de PRRSV en el vector pVAX1, creando pVAX1-F1. Las rondas sucesivas de recombinación utilizando enzimas de restricción específicas dieron como resultado la incorporación de fragmentos del dos al cinco, visualizados por un aumento en el tamaño del plásmido.
