Para comenzar, recoja las muestras descongeladas de tejidos murinos infectados con Salmonella con un par de pinzas. Insértelo rápidamente en el fondo de un molde de plástico que contenga agarosa líquida. Una vez completada la polimerización, use un bisturí para abrir el molde de plástico desde las esquinas.
Después de colocar una cuchilla en un micrótomo, transfiera la muestra con los dedos enguantados a una caja de muestras. Coloque la muestra debajo del micrótomo de manera que la superficie superior de la agarosa esté al mismo nivel que la hoja del micrótomo. Mueve el escenario para colocar el cubo de agarosa en el centro del objetivo.
Haga clic en el botón Slice en el software del tomógrafo hasta que se obtenga un corte intacto completo del cubo. A continuación, centre la lente del objetivo en la muestra de tejido en las direcciones x e y. Inicie el software láser, ajuste la longitud de onda a 800 nanómetros y luego encienda el láser.
Cierre las puertas del gabinete del microscopio. A continuación, apague todas las fuentes de luz de la habitación. Encienda los PMT y ajuste el voltaje a 750 voltios.
Ahora configure el obturador del microscopio en automático. A continuación, ajuste los voltajes de V1 y V2 a 20 y 1,71 respectivamente. Ajuste el eje z con el dispositivo z-piezoeléctrico hasta que llegue a la superficie del tejido.
Corta varias rodajas de 50 micrómetros de grosor. A continuación, para encontrar los bordes de la muestra, limite el área de imagen al tejido con una imagen mínima de la agarosa circundante. Después de apagar los PMT, establezca la longitud de onda del láser en 800 nanómetros.
Utilice el punto láser para encontrar las coordenadas de los bordes del tejido mientras cambia la platina. Después de confirmar las coordenadas, coloque el punto láser en el centro delantero derecho. Ahora cambie la longitud de onda a 940 nanómetros.
Ponga el obturador del microscopio en modo automático y, a continuación, ajuste el voltaje del obturador a 20 para V1 y a 1,71 para V2. Presione la opción de configuración de Mosaico 3D para comenzar a escanear. Después de la toma de imágenes, recoja las secciones de tejido del tanque de agua. Para unir las imágenes de mosaico, primero transfiera los datos del servidor de tomógrafos a la computadora Linux.
Abra el script de MATLAB StepOneStitchingAndArchive. m y localice la carpeta de origen. Cambie a la pestaña Editor y haga clic en Ejecutar.
La información de progreso se mostrará en la ventana de comandos. Busque las imágenes unidas en la subcarpeta llamada stitchedimages_100 en la carpeta de origen. Comprima los datos sin procesar con el comando tar y guárdelos como un solo archivo con la extensión de nombre de archivo tar.bz2.
Para entrenar la máquina de vectores de soporte, obtenga una vista previa de las imágenes unidas. Abra una imagen con el mismo nombre de archivo de cada subcarpeta con Fiji. Combine los tres canales en una imagen en color, luego ajuste el brillo de cada canal hasta que se vean señales claras de autofluorescencia de bacterias y tejidos.
Tenga en cuenta el nivel de intensidad máxima ajustado de cada canal. A continuación, abra el script de MATLAB StepTwoSegmentationAndAnalysis.m. Defina la carpeta de origen y los nombres de las imágenes para el entrenamiento, luego vaya a la pestaña Editor y haga clic en Ejecutar.
Cuando aparezca un cuadro de diálogo que solicite umbrales de color, rellénelo con los valores basados en la verificación manual anterior con Fiji. Seleccione las regiones para el fondo y las regiones de interés de acuerdo con los cuadros de diálogo. Aparecerán gráficos que muestran qué tan bien se ha entrenado el modelo y preguntarán si es necesario agregar más regiones.
Agregue más regiones de interés y antecedentes hasta que las bacterias se puedan segmentar claramente. El proceso de segmentación se ejecutará automáticamente y el progreso se puede ver en la ventana de comandos. A continuación, abra las imágenes del canal azul, que contiene señales de segundo armónico de colágeno.
Doble las imágenes del primer canal diez veces en los ejes x e y y guarde las imágenes reducidas en una nueva carpeta. Realice tres réplicas de imágenes de tamaño reducido dentro de la misma carpeta. Para la visualización en 3D, inicie el paquete de software de visualización Imaris en la vista Arena.
Ahora abra el archivo IMS o TIF. Ajuste las representaciones de color de los diferentes canales en la ventana de ajuste de la pantalla. Haga clic en Propiedades de la imagen en el menú Editar para establecer manualmente los valores mínimos o máximos y un valor para la corrección gamma.
Después de ajustar la apariencia de la imagen, exporte la vista actual con la herramienta Instantánea. Utilice el puntero de navegación para buscar una vista y, a continuación, utilice Agregar más para agregar fotogramas clave. Utilice el icono Animación para representar los datos 3D como una película.
Presione el botón rojo de grabación para crear la película, luego guárdela en la carpeta de destino y el tipo de archivo deseados. Se detectaron células individuales de Salmonella en órganos enteros de ratón, como el bazo, el hígado, los ganglios linfáticos mesentéricos y los parches de Peyer. La segmentación de las bacterias fluorescentes se confirmó mediante inmunohistoquímica.
Las células huésped se tiñeron in vivo inyectando un anticuerpo a los marcadores de superficie antes de la perfusión.
